分子生物学实验方法-1分子生物学.ppt
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1、5 分子生物学研究方法(上)DNA、RNA及蛋白质操作技术从20世纪中叶开始,分子生物学研究得到高速发展,主要原因之一是研究方法,特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分,只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上,这种跨越物种屏障、把来
2、自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。5.1重组DNA技术回顾 三大成就 40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题;50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题;50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达。重组DNA技术历史上的主要事件年份 事件 1869 FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944 O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D.He
3、rshey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA,并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一个遗传密码;F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964C.Yanofsky和S.Bren
4、ner等人证明,多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由 质粒DNA 所决定。1966M.W.Nirenberg,S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。1970H.O.Smith,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得第一个重组DNA 分子,73
5、年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体174基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠;A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。1982 美、英批准使用第一例基因工程药物-胰岛素;Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983获得第一例转基因植物。1984 斯坦福大
6、学获得关于重组DNA的专利。1986 GMO首次在环境中释放。1988 J.D.Watson出任人类基因组计划首席科学家。1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠-Oncomouse。1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996 完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。2001完成第一个人类基因组全序列测定。2004中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。2005中、美、日科学家联合完成水稻基因组全序列测定。限制性内切酶限制性核酸内
7、切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。1972年Boyer实验室第一个发现了核酸内切酶EcoRI的识别序列。命名:Escherichia coliRY13中第一个内切酶EcoRI.EcoRIEcoRVBsaISfiI同裂酶ApaIGGGCC/CPspOMIG/GGCCC同尾酶NcoIC/CATGGBspHIT/CATGA有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列,这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可能不同,识别和切割位点都相同的叫同序同切,识别位点相同但切割位点不同的叫同序异切酶。一类识别DNA分子中不同核苷酸序列,但能酶切产生相同黏性末端的限制性内切酶。由同尾
8、酶产生的DNA片段,是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。双酶切单酶切质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位,包括真核生物的细胞器(主要指线粒体和叶绿体)中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。严紧型质粒,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有12个质粒。松弛型质粒,当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有10-200份拷贝,如果用一定的药物处理(如氯霉素)抑制寄主蛋白质的合成还会使质
9、粒拷贝数增至几千份。功能:进行细胞间接合,并带有一些基因,如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。质粒 载体:多数质粒都含有半乳糖苷酶的前146个AA编码序列和调控序列。编码序列中包含了一个MCS,它不破坏读码框,不影响功能。宿主菌:编码半乳糖苷酶C端部分序列。分别编码的片段均无活性,但可融为一体,形成具有酶活的蛋白质。C限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶 生成3-5磷酸二酯键DNA聚合酶 探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶3切除末端磷酸基DNA外切酶 3末端切除单核苷酸噬菌体DNA外切酶 5末端切除单核苷酸重组
10、DNA实验中常见的主要工具酶转化外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化。早在1943年,Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。由于天然状态下DNA进入细胞的效率很低,在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞,经处理后的细胞就容易接受外界DNA,称为感受态细胞,再与外源DNA接触,就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理,就成为感受态细菌,当加入重组质粒并突然由4 转入42 作短时间处理,质粒DNA就能进入细菌;用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率,这称为电穿孔(electroporation)转
11、化法。将连接有所需要的DNA 的载体导入宿主细胞的常用方法有四种:转化,用质粒作载体所常用的方法。转染,用噬菌体DNA作载体所用的方法,这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。转染是转化的一种特殊形式。转导,用噬菌体作载体所用的方法,这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳,不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上,而是在离体情况下包上的,所以称为离体包装。注射,如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。核酸凝胶电泳技术 细菌转化与目标DNA分子的增殖 聚合酶链反应技术 实时定量PCR、基因组DNA文库构建5.2DNA基本操作技术5.2.1 核酸凝胶电泳技术在生理条件下,
12、核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团,呈离子化状态,DNA 和RNA 多核苷酸链称为多聚阴离子,把它们放置在电场当中,会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA 分子的迁移速度,取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。准备胶板配制琼脂糖凝胶倒胶上样溴化乙锭由于插入了溴化乙锭分子,在紫外光照射下,琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光,易于鉴定。DNA的迁移速度与构型有关用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像,即超螺旋,
13、线形和开环。(开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链,因此电泳速度最慢)三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋线形开环,线形的质粒在中间,而开环的质粒在最后。判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)原理:聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)主要是以PAGE为介质,根据DNA分子大小和电荷分离DNA分子。染色:银染法进行显色。银染的原理:1.银离子(一般是AgNO3)和DNA结合;2.还原剂甲醛把Ag+还原成银颗粒,最终DNA呈现为黑褐色。特点:根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序
14、列分析分离长度仅相差0.1%(即1000bp中的1bp)的核苷酸分子聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂N,N-亚甲双丙烯酰胺参与下,聚丙烯酰胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺和交联剂的浓度及比例决定的。普通的琼脂糖凝胶电泳,很难分离大于50kb的DNA分子,而要进行超大分子研究,要用到脉冲电场凝胶电泳(PFGE)脉冲电场凝胶电泳原理在脉冲电场中,DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替
15、变化,使得DNA分子能够随时调整其游动方向,以适应凝胶孔隙的无规则变化。与相对分子质量较小的DNA相比,相对分子质量较大的DNA需要更多的脉冲次数来更换其构型和方位,使其按新的方向游动。应用脉冲电场凝胶电泳技术,可成功分离到高达107bp的DNA大分子。脉冲电场凝胶电泳效果产气荚膜梭菌5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖准备转化态细胞42 热冲击电转化加入外源DNA细胞复苏平板筛选CaCl210%甘油蓝白斑筛选+抗生素+IPTG+X-gal要灵活运用,根据不同情况设计筛选策略!电转化仪利用噬菌体颗粒能够有效将DNA注入到宿主细胞这一特点,科学家又发明了DNA分子的体外包装法延伸:其他基因
16、导入方法5.2.3 聚合酶链反应技术模板引物DNA聚合酶dNTPMg2+变性退火延伸PCR 引物设计:引物的长度一般为15-30bp。引物在模板内最好具有单一性,特别是3端。引物序列的GC含量最好在40一60,且上下游引物序列GC含量的差异不要太大。避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构。引物二聚体引物特异性差(不专一)聚合酶(T aq 酶)Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus(Taq)中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。与一般酶不同,用Taq酶扩增DNA时常使3端凸出一个A,可用于TACloning.高保真PCR酶利用自身的35外切酶活性(pfuDNAPolymerase,
17、PrimeSTARHSDNAPolymerase等)能保证PCR产物的保真度,但扩增的PCR产物为不带A尾的平末端DNA片段,不能直接TA克隆。RT-PCR(反转录PCR)5.2.4 实时定量PCR什么是RealTimePCR?在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程,对起始模板进行定量分析的方法与普通PCR的区别普通PCR:在PCR结束后对终点产物进行定量分析。Real Time PCR:实时检测PCR扩增,在扩增的指数期对起始模板进行定量。RealTimePCR的数学原理RealTimePCR的数学原理Ct的定义:扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的
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- 分子生物学 实验 方法
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