Chapter 3 核酸化学.ppt

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1、第三章核酸化学l l 核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。l l 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。核酸概述第一节核酸是遗传物质的载体一、核酸的研究发现史l l 1868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种含磷量很高酸性物质，即现在被称为核酸的物质。1928年，F.Griffith的转换转化实验orand可分离ll1952年，Hershey、Chase T2噬菌体：3232PP和和3535SS分别标记核酸和蛋白分别标记核酸和蛋白ll1953年，Watson、Crick DNA双螺旋模型ll1981年，Cech 核酶（Riboz

2、yme）98 98核中（染色体中）核中（染色体中）真核 真核 线粒体（线粒体（mDNA mDNA）核外 核外 叶绿体（叶绿体（ctDNA ctDNA）DNA DNA 拟核 拟核 原核 原核 核外：核外：质粒（质粒（plasmid plasmid）病毒：病毒：DNA DNA病毒 病毒二、核酸的种类和分布 核酸分为两大类：脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid（DNA）核糖核酸 ribonucleic acid（RNA）RNA主要存在于细胞质中l tRNA(transfer RNA)l rRNA(ribosomal RNA)（真核与原核的区别）l mRNA(messeger RN

3、A)（真核与原核的区别）l 其它l RNA病毒：SARS、TSV三、分子生物学的中心法则第二节 核酸的基本化学组成核酸 核苷酸核苷磷酸碱基戊糖元素组成：C H O N P 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定。组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。一、戊糖RiboseRiboseDeoxyriboseDeoxyribose二、碱基1.嘌呤碱

4、（Purine bases）1 12 23 34 45 56 69 97 78 8l腺嘌呤AdenineAAl鸟嘌呤guanineGG2.嘧啶碱（Pyrimidine bases）1 12 23 34 45 56 6尿嘧啶uracilU胞嘧啶cytosineC胸腺嘧啶thymineTCH3 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。三、核苷（nucleoside）核苷 戊糖+碱基(糖苷 P19)糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键1 12 2 3 34 45 5(OH)1 12 2 3 34 45 5(OH)假尿苷（假尿苷（）次黄苷（肌苷）I黄嘌呤

5、核苷 X二氢尿嘧啶核苷 DHU取代核苷的表示方式7-甲基鸟苷 m7G5 5OHAdenosine Guanosine Cytidine Uridine四、核苷酸（nucleotide）核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸HHHHHHH H H五、核苷酸衍生物l l1.1.继续磷酸化继续磷酸化AMPADPATP2.环化磷酸化l cAMP l cGMP3.辅酶 NAD、NADP、FAD六、多聚核苷酸（核酸）l l 多聚核苷酸是通过一个核苷酸的 多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C C3 3-OH-OH 与另一分子核苷 与另一分子核苷酸的 酸的5-5-磷酸基形成 磷酸基形成3,5-3,5-磷酸二酯键相连而

6、成的链 磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。状聚合物。5533l 5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）l 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。注意：核苷酸链的方向与二酯键的方向相反多聚核苷酸的表示方式：1.竖线式：P482 P4822.文字式：DNA RNA5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU第三节 DNA的结构l l一、一、DNA的一级结构l l脱氧核糖核酸的排列顺序脱氧核糖核酸的排列顺序l l可以用碱基排列顺序表示可以

7、用碱基排列顺序表示l l连接键：连接键：33，5-5-磷酸二酯键磷酸二酯键l l磷酸与戊糖依次相连形成主链骨架磷酸与戊糖依次相连形成主链骨架l l碱基形成侧链碱基形成侧链l l多核苷酸链均有多核苷酸链均有5-5-末端和末端和3-3-末端末端 DNA DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于 生物界物种的多样性即寓于DNA DNA分子中四种核苷酸千变万 分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。化的不同排列组合之中。2.基因与基因组基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。

8、蛋白质（mRNA 蛋白质）产物 tRNA RNA rRNA 调节功能：调节基因无产物 作用未知结构基因基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒DNA）bp（碱基对）103 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012人两栖类鱼类藻类酵母细菌E.Coli病毒质粒各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小3.原核生物基因组特点l 重复序列少，多位编码区l 多为操纵子形式组织l 有重叠基因存在4.真核生物基因组特点l 以染色体存在l 重复序列多 基因组计划人类基因组计划（Human Genome P

9、roject，HGP）：19902002酵母基因组计划（YGP）：1989-1996大肠杆菌（E.Coli）：1997negative control二、DNA的二级结构（一）Chargaff 规律 1950年（1）所有生物的DNA中，A=T，G=C，A+C=G+T，且A+G=C+T。（2）DNA的碱基组成具有种的特异性。（3）DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。（4）年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。(二)DNA的双螺旋模型l l19531953年年，J.J.WatsonWatson和和F.F.Crick Crick 在在前前人人研研究究工工作作的的基基础础上上，根根据据D

10、NADNA结结晶晶的的X-X-衍衍射射图图谱谱和和分分子子模模型型，提提出出了了著著名名的的DNADNA双双螺螺旋旋结结构构模模型型，并并对对模模型型的的生生物物学学意意义义作作出出了了科学的解释和预测。科学的解释和预测。l l在在DNADNA分分子子中中，嘌嘌呤呤碱碱基基的的总总数数与与嘧嘧啶啶碱碱基基的的总总数相等。数相等。DNA双螺旋模型要点B型结构 a.两条链反向平行，右手螺旋;b.碱基在内（AT，GC），碱 基平面垂直于螺旋轴,戊糖环在外，平行于螺轴；c.双螺旋每转一周为10碱基对（bp），上升3.4nm;d.氢键维系两链的结合；e.碱基自由排列。2.0 nm小沟大沟（1）B-DNA

11、：典 型 的Watson-Crick双螺旋DNA右手双螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺距：3.22nm（2）A-DNA右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。（3）Z-DNA左手螺旋，外形细长。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。双螺旋DNA的结构参数类型 类型 旋转方向 旋转方向 螺旋直径 螺旋直径（nm nm）螺距 螺距（nm nm）每转碱基 每转碱基对数目 对数目碱基对间垂直 碱基对间垂直距离（距离（nm nm）碱基对与水 碱基对与水平面倾角 平面倾角A A DNA DNAB B DNA DNAZ Z DNA DNA右 右右 右左 左2.55 2.

12、552.37 2.371.84 1.842.53 2.533.54 3.544.56 4.561 1 1 110 1012 120.255 0.2550.34 0.340.27 0.2719 19 0 09 9稳定双螺旋的力 氢键 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力）离子键等 则：DNA变性剂（热、pH、脲/酰胺、有机溶剂）三股螺旋DNA K.Hoogsteen 1963通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：oligo(Py):oligo(Pu)oligo(Py/Pu)第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoog

13、steen配对。T=A:A,CG：C+T=A:T CG：GDNA的存在形式二、DNA的三级结构l l DNA DNA三级结构：指 三级结构：指DNA DNA双螺旋的进一步扭曲与折叠形成的特 双螺旋的进一步扭曲与折叠形成的特定构象，包括 定构象，包括三方面内容 三方面内容（P490 P490）原核 原核 双链环状 双链环状DNA DNA（dcDNA dcDNA）病毒 病毒 单链环状 单链环状DNA DNA（scDNA scDNA）单链线性 单链线性DNA DNA（ssDNA ssDNA）负超螺旋 负超螺旋几个参数：几个参数：连环数：指双链的互绕数，连环数：指双链的互绕数，L L（linking

14、number linking number）扭转数：指螺旋圈数，扭转数：指螺旋圈数，T T（twisting number twisting number）超螺旋数：即缠绕数，超螺旋数：即缠绕数，W W（writhing number writhing number）L=T+W拓扑异构酶：I（L01）、II（L0-2）真核 双链线性DNA（dsDNA）：P495核小体纤丝突环玫瑰花环螺旋圈染色体第四节 RNA的结构与功能一、结构特点1.碱基组成 A、G、C、U（AU/GC）稀有碱基较多，稳定性较差，易水解2.多为单链结构，少数局部形成螺旋3.分子较小4.分类l mRNA（hnRNA 核不均一R

15、NA）l tRNA l rRNA（snRNA/asRNA）l 少数RNA病毒二、tRNA占RNA总量的15一种氨基酸对应最少一种tRNAl分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成。l分子中含有较多的修饰成分。l3-末端都具有CpCpAOH的结构。l三叶草形（二级结构）：1个臂、4个环tRNA的三级结构三、rRNA占RNA总量的80原核生物 原核生物 真核生物 真核生物核糖体 核糖体 rRNA rRNA 核糖体 核糖体 rRNA rRNA 30s 30s70s 70s 50s 50s16s 16s5s 5s、23s 23s 40s 40s80s 80s 60s 60s 18s(17S)1

16、8s(17S)5s 5s、5.8s 5.8s、28s(26S)28s(26S)四、mRNA和hnRNA占细胞总RNA的35l l 真核细胞 真核细胞mRNA mRNA的 的3-3-末端有一段长达 末端有一段长达200 200个核苷酸左右 个核苷酸左右的聚腺苷酸 的聚腺苷酸(polyA polyA)，称为 称为“尾结构 尾结构”，5-5-末端有 末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为 一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽结构 帽结构”。P484 P484五、snRNA（small nucleic RNA 核小RNA）scRNA（small cytoplasmic RNA）asRNA（antisense RNA）

17、第五节 核酸的性质一、一般的理化性质l 两性解离/一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），可 溶于水，不溶于有机溶剂l线性大分子（粘度高、抗剪切力差）l可用电泳或离子交换（色谱）进行分离l室温条件下，DNA在碱液中变性，但不水解，RNA水解l加热条件下，D核糖浓盐酸苔黑酚 绿色 D2脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫色二、核酸的紫外吸收特性l l 在核酸分子中，由于嘌呤碱 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有 和嘧啶碱具有共轭双键 共轭双键体系，体系，因而具有独特的紫外线吸收 因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在 光谱，一般在260nm 260nm左右有最 左右有最大吸收峰，可以作为核酸及 大吸收峰，可以作为

18、核酸及其组份定性和定量测定的依 其组份定性和定量测定的依据。据。l l 以 以A A260 260/A/A280 280进行定性、定量 进行定性、定量l l DNA DNA和 和RNA RNA溶液中加入溴化乙 溶液中加入溴化乙锭（锭（EB EB），在紫外下发出荧），在紫外下发出荧光 光三、核酸的变性、复性与分子杂交1.1.变性变性l l 稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链 稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的一级结构 结构的过程。核酸的一级结构(碱基顺序 碱基顺序)保持不变。保持不变。l l 变性表征 变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升

19、高、紫外吸 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加 收增加（增色效应）（增色效应）l l 变性因素 变性因素 pH pH（11.3 11.3或 或5.0 5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）低离子强度 低离子强度 加热 加热l l DNA DNA的变性过程 的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因 是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，此，通常将加热变性使 通常将加热变性使DNA DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称 的双螺旋结构失去一半时的温度称熔解温度或熔点，用 熔解温度或熔点，用T Tm m表示 表示。l l 一般 一般DNA DN

20、A的 的T Tm m值在 值在82-95 82-95 C C之间。之间。DNA DNA的 的T Tm m值与分子中的 值与分子中的G G和 和C C的 的含量 含量有关，也与 有关，也与DNA DNA的均一性和介质中离子强度有关。的均一性和介质中离子强度有关。l l G G和 和C C的含量高，的含量高，T Tm m值高。因而测定 值高。因而测定Tm Tm值，可反映 值，可反映DNA DNA分子中 分子中G,G,C C含量，可通过经验公式计算：（含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 G+C)%=(Tm-69.3)X2.442.热变性和Tm3.核酸的复性l l 变

21、性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为 螺旋结构的过程称为复性 复性。l l DNA DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一 复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有 般只能得到部分的恢复，具有减色效应 减色效应。l l 将热变性的 将热变性的DNA DNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNA DNA不可能复性。不可能复性。变性的 变性的DNA DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为 缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火 退火”。退火温度 退火温度T Tm m 25 25l l 复

22、性影响因素 复性影响因素 片段浓度 片段浓度/片段大小 片段大小/片段复杂性（重复序列数目）片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度 溶液离子强度 4.分子杂交l lDNADNA单链与在某些区域有互补序列的异源单链与在某些区域有互补序列的异源DNADNA单链单链或或RNARNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为分子称为杂交杂交DNADNA分子分子。l l核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。重要意义。l lSouthern Southern 杂交（杂交（Southern Southern bl

23、otingbloting）l lNorthern Northern 杂交（杂交（Northern Northern blotingbloting）l lWestern Western 杂交杂交（Western Western blotingbloting）引物引物*引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。*引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性。35555.PCR技术基因组PCR 原理图 333变性、退火延伸变性、退火、延伸3四、核酸的序列测定 双脱氧链终止法（Sanger酶法）本 章 小 结l l核酸是遗传物质载体的证明和研究历史核酸是遗传物质载体的证明和研究

24、历史l l核酸的化学结构：戊糖、碱基（核酸的化学结构：戊糖、碱基（AA、TT、GG、CC、UU），），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号）l lDNADNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定）、二级结构（及基因组、序列测定）、二级结构（Watson Watson CrickCrick双螺旋模型、双螺旋模型、ZZDNADNA）、结构维持的化学键）、结构维持的化学键l lRNARNA结构与功能：碱基组成特点、结构与功能：碱基组成特点、RNARNA的种类结构及的种类结构及功能功能l l核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交核酸的性质：酸碱性、变性与复性、分子杂交