2023年同济大学现代仪器分析课件高效液相色谱知识扫盲加可作为查找工具.pdf

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1、高效液相色谱知识收藏 Agilent1100 高压液相色谱仪基本操作步骤 Agilent1100液相基本操作步骤(一)、开机：（二）数据采集方法编辑：（三）、数据分析方法编辑:(四)、关机:Agilent1100 高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如 ACN 适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。4、带 seal-wash的 1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分23滴的速度虹

2、吸排出，溶剂不能干涸。维护知识问答 1、为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。2、为什么 HPLC 用缓冲盐时要加在线 Seal-wash 选项？HPLC 用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线 Seal-w

3、ash 选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol 或大于0.1mol 时,必须使用该在线冲洗选项.清洗液配制:90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3 滴/min 的速度虹吸流下，不能干涸。4、流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如 O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用 FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较：氦气

4、脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1100LC 真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=47）。A 溶剂过滤。B：用及配的蒸馏水及磷酸盐缓

5、冲液 C：溶剂中加入0.0001-0.001M 的叠氮化钠.D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。8、使用梯度比例发时要注意那些事项？当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀 A 接水相/盐溶液，D 接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。

6、液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成 1、液相色谱柱的结构：a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。b、柱填料：液相色谱柱分类是依据填料类型而定。正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在310 m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他的反相填料还有键合 C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在310 m之间。二、液相色谱柱的使用：色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起

7、来 1、样品的前处理：a、流动相溶解样品。b、除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用

8、UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。3、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm 的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为4.0mm 柱，流速0.8mlmin 为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或

9、乙腈的含量)。高压液相色谱 HPLC 培训教程(一)I概论 一、液相色谱理论 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱

10、法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度510m。适用于分离分子量2001000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。2液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以

11、减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如 C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色

12、谱法 一般用非极性固定相（如 C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH 值。但需要注意的是，C18和 C8使用的 pH 值通常为2.57.5（28），太高的 pH 值会使硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在 pH 1.510范围操

13、作。正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高中 中低 流动相极性 低中 中高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子

14、交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的 pH 值和离子强度影响。pH 值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成

15、很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用 ODS 柱（即 C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L 的离子对试剂，在一定的 pH 值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其 pH 值、离子强度有关。5排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。高压液相色谱

16、HPLC 培训教程(三)1塔板理论的基本假设 塔板理论是色谱热力学平衡理论。分馏塔,组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。塔板理论导出了色谱流出曲线方程，解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。2色谱流出曲线方程及定量参数（峰高

17、h 和峰面积 A）三、速率理论（又称随机模型理论）1液相色谱速率方程 高压液相色谱 HPLC 培训教程(四)HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。一、输液泵 1泵的构造和性能 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。性能：流量稳定，其 RSD 应0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；流量范围宽，分析型应在0.110 ml/min 范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；输出压力高，一般应能达到150300kg/cm2；液缸容积小；密封性能好，耐腐蚀。恒压泵（受柱阻影响，流量不稳定）和恒流泵【按性质分】。螺旋注射泵（太大）、柱

18、塞往复泵（目前最多使用）和隔膜往复泵 结构分。柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达400kg/cm2。其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。2泵的使用和维护注意事项 为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性 防止任何固体微粒进入泵体，应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏滤过，泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相（由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细

19、晶体），不可长时间。纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作时流动相被用完，空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。输液泵的超过工作压力使高压密封环变形，产生漏液。流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。3梯度洗脱 （等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱）二、进样器 六通进样阀或自动进样器：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。三、色谱柱 色谱分离是核心，心脏。柱效高、选择性好，分析速度快，。粒

20、填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10m等，一般1030cm 左右的柱长满足复杂混合物分析 柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术（也有管壁效应）内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。2柱的发展方向 柱长310cm，填料粒径23µm。为提高分析灵敏度，窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm 的微径柱（microbore）优点是：节省流动相；灵敏度增加；样品量少；能使用长柱达到高分离度

21、；容易控制柱温；易于实现 LC-MS 联用。四、检测器 HPLC 的检测器要求灵敏度高、噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感）、线性范围宽、重复性好和适用范围广。1分类（见仪分）2性能指标 3紫外检测器(ultraviolet detector)。UV 最广泛（原理是 Lambert-Beer 定律）紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，可于制备色谱。由于灵敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用 UV 检测器进行微量分析。但要注意波长范围及溶剂中含有吸光杂质，则会提高背景噪音，降低灵敏度（实际是提高检测限）及梯度洗脱时，还会产生漂移。高压液相色

22、谱 HPLC 培训教程(六)IV固定相和流动相 1）硅胶基质（担体）高强度，提供一个表面，可硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料，极性非极性都可用。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定，则常 pH 范围为28。2）氧化铝 3）聚合物 2基质的选择 硅胶基质的填料被用于大部分的 HPLC 分析，尤其是小分子量的被分析物 聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。二、化学键合固定相 将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官

23、能团的类型来改变分离的选择性。1键合相的性质 目前，化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应，形成 Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称封端（或称封尾、封顶，end-capping），以提高键合相的稳定性。有些 ODS 填料是不封尾的，以使其与水系流动相有更好的湿润性能。键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度(指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例)来表示。硅胶键合相应在 pH=28的介质中使用。2键合相的种类 极性和非极性键合相两种。常用的极性键合相:氰基(-CN)、

24、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相(常正相色谱)，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。常用的非极性键合相:各种烷基(C1C18)和苯基、苯甲基等，以 C18应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。C18柱稳定性较高(长的烷基链保护了硅胶基质)但

25、 C18基团空间体积较大，使有效孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低。3固定相的选择 分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力；氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，故被广泛用于糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等，因为它们之间会发生反应生成 Schiff 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相。利用特殊的反相色谱技术，例如反相离子抑制技

26、术和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键合相，它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离 苯基键合相适用于分离芳香化合物。三、流动相 1流动相的性质要求 低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性。选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子 k 降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子 k 升高。因此，k 值是流动相组成的函数。塔板数 N 一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：流动相应不改

27、变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。必须与检测器匹配。使用 UV 检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。粘度要低（应2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100以下的流动相。对样品的溶解度要适宜。如果溶解度

28、欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。样品易于回收。应选用挥发性溶剂。2流动相的选择 在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但 Snyder 则推荐采用乙腈-

29、水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185205nm 处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的 k 值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：C 乙腈0.32C 2甲醇0.57C 甲醇 C 四氢呋喃0.66C 甲醇 C 为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。3流动相的 pH

30、 值 采用反相色谱法分离弱酸（3pKa7）或弱碱（7pKa8）样品时，通过调节流动相的 pH 值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的 pH 值越小，组分的 k 值越大，当 pH 值远远小于弱酸的 pKa 值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L 磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L 磷酸盐缓冲液和30mmol/L 三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除

31、峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。4流动相的脱气 HPLC 所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂 pH 的变化，对分离或分析结果带来误差。溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm 以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）

32、。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。除去流动相中的溶解氧将大大提高 UV 检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好，1020分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml 溶液需超声2030min 方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂

33、，容器内液面不要高出水面太多。离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在14小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机。一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。5流动相的滤过 所有溶剂使用前都必须经0.45µm（或0.22&micr

34、o;m）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明已滤过）。用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于 HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。6流动相的贮存 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于 HPLC 系统，可能造成柱

35、效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。7卤代有机溶剂应特别注意的问题 卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质，能与 HPLC 系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解，不能存放太久。卤代溶剂（如 CCl4、CHCl3等）与各种醚类（如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等）混合后，可能会反应生成一些对不锈

36、钢有较大腐蚀性的产物，这种混合流动相应尽量不采用，或新鲜配制。此外，卤代溶剂（如 CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产生结晶。总之，卤代溶剂最好新鲜配制使用。如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产生类似问题。8HPLC 用水 HPLC 应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱的洗脱。进行 HPLC、GC、电泳和荧光分析，或在涉及组织培养时，没有有机物污染是非常重要的。测高锰酸钾颜色保留时间的定性方法反应慢，对很低水平的有机物（对 HPLC 可能还是太高了）不够灵敏，特别是不能定量。总有机碳(TOC)分析仪（把有机物氧化成 CO2，测游离的 CO2）常用于 I 类（N

37、CCLS）水中低浓度有机物的测定。I 类水标准：NCCLS ASTM 电阻率，Mcm，25，最小 10.0 18.0 硅酸盐，mg/L，最大 0.05 0.003 微粒，µm 滤器 0.22 0.2 微生物，CFU/ml 10 分三档 美国药典24版（2000年）要求 TOC0.5 mg/L（用标准蔗糖溶液1.19 mg/L），电导率在室温 pH 6时2.4µS/cm（即0.42 Mcm）。HPLC 级水增加吸收特性：在1cm 池中，用超纯水作空白，在190nm、200nm 和250400nm 的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。增加不挥发物，3ppm（中国

38、药典纯水10ppm）。高压液相色谱 HPLC 培训教程(七)VHPLC 应用 一、样品测定 1流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为615分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。2样品配制：溶剂；容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。3记录时间：第一次测定时

39、，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。4进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数 HPLC 系统采用定量环（10ml、20ml 和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）5计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。6仪器的使用：流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。柱在线时，增加流速

40、应以0.1ml/min 的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.10.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含510%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更

41、换水）。二、方法研究 1波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在 HPLC 中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC 测定的面积将会很小。2流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 一、对起草单位的要求：1HPLC 法用于药品的有关物质检查或含量测定时，需提供建立 HPLC 法的依据及参考文献。2应对建立的方法进行论证，按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。3建立方法时，应考虑下列事项

42、：首选填料为十八烷基键合硅胶，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱。流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的 pH 值应为78；如为酸性药物，流动相的 pH 值应为34。尽可能选用流动相作为溶剂，如未能选用，应说明原因。内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品，应与待测物质化学结构相似，理化性质接近，峰的响应值相当，以及分离度应大于1.5，另应考虑对照品的来源问题。检测器首选 UV 检测器。4采用 HPLC 法进行有关物质检查时，如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大，应首选自身对照法，而不宜选用面积归一化法。5HPLC 法

43、用于原料药的含量测定。如以内标法测定含量，应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质；如以外标法测定含量，对照品与供试品应各取样2份，对照晶溶液各进样3次，供试品溶液各进样2次，计算相对标准差（RSD 应不得大于 l.5）。二、对复核单位的要求：1按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。2当 HPLC 法用于有关物质的检查时，应进行最低捡出量试验。3应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性，并作出评价。高效液相色谱仪中反相 HPLC 柱子的清洁和再生反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的

44、固定相都是天然的疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小来分离的，含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离。固定相上还有少数物质，如混合相（例如苯基己基）、末端封闭和非末端封闭种类和极性嵌入相也存在于这些键合硅胶上。还有很多填料用于反相色谱，包括聚合物，聚合物表面涂上硅胶和氧化铝，无机有机混合物，涂层氧化锆，和石墨化碳。不同种类的固定相有他们自己的优点和缺点。反相色谱柱利用各种流动相和添加物可以有很多的应用。一些技术利用添加物可以改变或修饰填料的表面。有时候这些添加物有可能会污染键合相表面。硅胶表面因为有着疏水键合相而有一些别的化学性质。残留的硅烷醇存在于所有的硅胶键合填料中

45、。这些硅烷醇具有弱酸性，因此能与某些待分析物合基质成分，特别是碱性成分。因为硅烷醇的 pKa 值大约是4.5，离子化能在中性 pH 条件下发生因此与阳离子产生静电相互作用就有可能发生。较老的 A 型硅胶能容纳高浓度金属离子（有时候100ppm 或更多），而这能使硅胶表面的酸性更大甚至能发生金属鳌合现象或清除一些化合物。残留硅烷醇在非末端封闭的硅胶合短链键合相如 C2或 C4上更让人烦恼。使用者必须清楚他们所用的固定相表面特殊性质和可能的分析物固定相表面的相互作用，这样当他们使用反相方法时才能考虑到可能的基质相互作用。例如，非常疏水的样品基质如玉米油，高芳香物质，和蜡能粘住固定相装填表面并且改变

46、他们的性质。含有蛋白质物质的生物流体也能吸附在装填表面。尽管分析者想尽最大努力来保护 HPLC 柱子，某些分析物基质污染能使固定相受到有害的影响。当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的柱子能产生反压问题。被污染的反相柱子必须清洗和再生才能恢复原来的操作条件。这部分的柱子观察将讨论可行的方法使柱子回复原来的或差不多原来的状态。因为键合硅胶柱子是最受欢迎的，我重点讲述这种柱子。最后，我将讨论别的反相柱子的清洁步骤。什么导致反相柱子污染产生？通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东西。盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与 HPLC

47、柱发生相互作用的物质。这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值。那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者是负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。这些行为通常只有通过平行实验才能发现。有着中等保留值的样品能被缓慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现。如果足够的污

48、染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，使柱子无法工作以及在堵塞处产生空体积。清洗硅胶键合柱子 再生被污染 HPLC 柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时候，经过多次操作以后的色谱柱用90100的溶剂 B（双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗20个体积可以清除污染物。（表2列举了不同规格的 HPLC 柱子的空体积，因此读者能方便地确定相应柱子冲洗的体积。）例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。如果你使用的是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换

49、到高浓度有机溶剂可能会使 HPLC 流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即把缓冲液换成水）。冲洗510个体积以后才更换强溶剂。有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子乐，如果污染物是非生物物质，使用者可以跳过一个或多个另外的有机溶剂去除污染物。溶剂与溶剂之间的组合有很多。到柱子厂家的网页上能找到推荐的溶剂系统。一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性物

50、质如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列：100甲醇 100乙晴 75乙晴25异丙醇 100异丙醇 100二氯甲烷 100正己烷 用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲