基因工程的酶学基础-PowerPoint演示文稿57309.pptx

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1、基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 （restriction endonucleaserestriction endonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种特定核分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割苷酸序列，并由此切割DNADNA双链结构的核苷酸内双链结构的核苷酸内切酶。切酶。寄主控制的限制（寄主控制的限制（restrictionrestriction）与修饰与修饰(modif

2、ication)(modification)现象：现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（饰现象简称（R/MR/M体系）。体系）。细菌的细菌的R/MR/M体系类似于免疫系统，能辨别体系类似于免疫系统，能辨别自身的自身的DNADNA与外来的与外来的DNADNA，并能使后者降解掉。，并能使后者降解掉。R/MR/M体系：体系：寄主是由两种酶活性配合完成的寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶另一种是核酸内切限

3、制酶 E.E.colicoliB B含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 当当(k)(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.E.colicoliB B时，由于时，由于其其DNADNA中有中有EcoBEcoB核酸酶特异识别的碱基核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而序列，被降解掉。而E.E.colicoliB B的的DNADNA中虽中虽然也存在这种特异序列，但可在然也存在这种特异序列，但可在EcoBEcoB甲甲基化酶的作用下，催化基化酶的作用下，催化S-S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸（SAMSAM）将甲基转移给限制酶识别序列）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基

4、化。的特定碱基，使之甲基化。EcoB EcoB核酸酶核酸酶不能识别已甲基化的序列。不能识别已甲基化的序列。R/MR/M体系的作用：体系的作用：保护自身的保护自身的DNADNA不受限制；不受限制；破坏外源破坏外源DNADNA使之迅速降解使之迅速降解限制性内切酶本是微生物细胞中用于专限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于是细胞中的一种防御机制。由于R/MR/M现现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。重要的工具酶。根

5、据酶的功能、大小和反应条件，及切根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶割的特点，可以将限制性内切酶分为三类：分为三类：型酶、型酶、型酶、型酶、型酶型酶型酶：型酶：19681968年，年，M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在E.E.colicoliB B和和E.E.colicoliK K中分离出的核酸内切酶。中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需分子量较大，反应需MgMg+、S-S-腺苷酰腺苷酰-L-L-甲硫甲硫氨酸（氨酸（SAMSAM）、）、ATPATP等。这类酶有特异的识别等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是

6、随机位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。的，所以在基因工程中应用不大。型酶型酶 19701970年，年，H.O.SmithH.O.Smith和和K.W.WilcoxK.W.Wilcox在流感嗜在流感嗜血血RdRd株中分离出来的限制酶。株中分离出来的限制酶。分子量较小（分子量较小（10105 5DaDa），只有一种多肽，），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需通常以同源二聚体的形式存在。反应只需MgMg+的存在，并且具有以下两个特点，使这的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识

7、别位点是一个回文对称结构，并且切割位识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。点也在这一回文对称结构上。许多许多型酶切割后，可在上形型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重组。成粘性末端，有利于片段的重组。型酶型酶 这这类类酶酶可可识识别别特特定定碱碱基基顺顺序序，并并在在这这一一顺顺序序的的33端端2426bp2426bp处处切切开开，所所以以它它的的切切割割位位点点也也是是没没有特异性的。有特异性的。型酶的基本特性型酶的基本特性 1.1.在在DNADNA双链的特异性识别序列部位，双链的特异性识别序列部位，切割切割DNADNA分子，产生链的断裂。分子，产生链的断裂

8、。2.2.两个单链断裂部位在两个单链断裂部位在DNADNA分子上的分分子上的分布，通常不是彼此直接相对的布，通常不是彼此直接相对的 3.3.因此，断裂的结果形成的因此，断裂的结果形成的DNADNA片断，片断，也往往具有互补的单链延伸末端。也往往具有互补的单链延伸末端。核酸内切酶作用后的断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式 粘性末端粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、但又是：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的成具有粘性末端的DNADNA片断。片断。具有具有3-OH3-OH（Pst1 Pst1

9、），或），或5-OH(EcoR1)5-OH(EcoR1)的粘性末的粘性末端。端。Pst1 EcoR1 Pst1 EcoR1 5CTGCAG 3 5GAATTC 3 5CTGCAG 3 5GAATTC 3 3GACGTC 5 3CTTAAG 5 3GACGTC 5 3CTTAAG 5 平末端平末端 两条链上的断裂位置是处在一个两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的形成具有平末端的DNADNA片断。不易片断。不易重新环化。重新环化。同裂酶（同裂酶（isoschizomers)isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核

10、酸内指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性敏感性不同。不同。Example:Example:限制酶限制酶HpaHpa和和MspMsp是一对同裂酶是一对同裂酶(CCGG)(CCGG)，当靶序列中一个当靶序列中一个5-5-甲基胞嘧啶时甲基胞嘧啶时HpaHpa不能进行不能进行切割，而切割，而MspMsp可以。可以。同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的

11、核酸内切酶。利用同尾酶可使切割粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。位点的选择余地更大。杂种位点（杂种位点（hybrid sitehybrid site）：由一对同尾酶分别产）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamHBamH G G GATC GATC C C BclBcl T T GATCGATC A A C C CTAGCTAG G A G A CTAGCTAG T T 杂种位点（杂种位点（hybrid sitehybrid site）由一对同尾

12、酶分别由一对同尾酶分别 产生的粘性末端共价结合形成的位点。产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamHBamH G G GATC GATC C C BclBcl T T GATCGATC A A C C CTAGCTAG G A G A CTAGCTAG T T 杂种位点杂种位点 ：GATCGATC C C（BamH BamH ）CTAG CTAG T T（BclBcl ）限制片断的末端连接作用限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的分子间的连接：不同的DNADNA片断通过互片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连补

13、的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。末端之间的碱基配对而形成的环形分子。限制酶的特性限制酶的特性a.a.限制酶识别靶序列同限制酶识别靶序列同DNADNA的来源无关；的来源无关；b.b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。制酶只具一个限制位点的质粒）。限制性核酸内切酶的命名原则：限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第一个字母。第二

14、、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：例：EcoR IEcoR I:来自于来自于E Es scheria cheria cocoli li RY13 RY13的第一个限制的第一个限制酶。酶。影响核酸内切酶活性的因素：影响核酸内切酶活性的因素：1.DNA1.DNA的纯度：的纯度：DNaseDNase的污染的污染(Mg+)(Mg+)a.a.

15、增加核酸内切限制酶的用量，增加核酸内切限制酶的用量，b.b.扩大酶催化反应的体系（扩大酶催化反应的体系（稀释稀释），），c.c.延长酶催化反应的保温时间。延长酶催化反应的保温时间。加入亚精胺提高酶的消化作用，需加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当适当的温度。的温度。2.DNA2.DNA的甲基化程度的甲基化程度3.3.酶切消化反应的温度：酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度大多数酶的标准反应温度 37 37度。度。4.DNA4.DNA的分子结构：的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒或病毒DNADNA所需要的酶量要比消化线性所需要的酶量要比消化

16、线性的的DNADNA高高2929倍。倍。核酸内切限制酶标准的缓冲液核酸内切限制酶标准的缓冲液1.1.氯化镁、氯化钠或氯化钾：氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的不正确的NaClNaCl或或Mg+Mg+浓度，会降低限制酶的活性，浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。还可能导致识别序列的改变。2.Tris-HCl 2.Tris-HCl：维持最适的维持最适的pHpH值（值（pH pH 7.47.4）。）。3.-3.-巯基乙醇或二硫苏糖醇（巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTTDTT）：维持酶的稳定性维持酶的稳定性。4.4.牛血清蛋白（牛血清蛋白（BSABSA）：维持酶的稳定性维持酶的稳定性。核酸内切

17、限制酶对核酸内切限制酶对DNADNA的消化作用的消化作用1.1.核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用。列发生作用。2.2.核酸内切限制酶对核酸内切限制酶对DNADNA的局部消化的局部消化完全的酶切消化：完全的酶切消化：识别序列识别序列n n个碱基的核酸内切个碱基的核酸内切限制酶，对限制酶，对DNADNA的切割能达到每隔的切割能达到每隔4 4n n切割一次切割一次的水平。的水平。局部酶切消化：局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的不让核酸内切限制酶对大量的DNADNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限

18、制片断产物，进行不完全的限制酶所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。消化反应。a.a.缩短酶切的消化反应的保温时间缩短酶切的消化反应的保温时间 b.b.降低反应的温度（降低反应的温度（37-437-4）结束酶的活性。）结束酶的活性。3.3.核酸内切限制酶对核酸内切限制酶对真核生物基因组真核生物基因组的消化的消化作用作用小分子量的片断小分子量的片断-少少 （电泳（电泳-容易分离目的片断）容易分离目的片断）大分子量的片断大分子量的片断-多（基因文库多（基因文库）连接酶（连接酶（DNA DNA ligaseligase）与分子的体外连接）与分子的体外连接末端核苷酸转移酶（末端核苷酸转移酶

19、（terminal transferaseterminal transferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal terminal deoxynucleotidyl transferasedeoxynucleotidyl transferase），它是从小牛胸腺），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化甲胂酸缓冲液中，能催化55脱氧核苷三磷酸进脱氧核苷三磷酸进行行5533方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性酸分子加到线性

20、DNADNA分子的分子的3-OH3-OH末端。末端。它不需要模板，可以用含有的它不需要模板，可以用含有的3-OH3-OH片段为引物，在片段为引物，在3-OH3-OH端加入核苷酸达几百个。端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有它作用的底物可以是具有3-OH3-OH末端的单链末端的单链DNA,DNA,也可以是具有也可以是具有3-OH3-OH突出末端的双链突出末端的双链DNADNA 用途：用途：1.1.催化催化-3232P P-3-3-脱氧核苷酸标记脱氧核苷酸标记DNADNA片断的片断的3 3 末端。可用于测序的终止，一位不含游离的末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3-OH3-OH末端。末

21、端。2.2.催化非放射性的标记物掺入到催化非放射性的标记物掺入到DNADNA片断的片断的3-3-末端：末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。抗生物素蛋白结合物的接受位点。3.3.用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。从而形成粘性末端。碱性磷酸酶：碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（来自于大肠杆菌（bacterial alkaline bacterial alkaline phosphatase BAPphosphatase BAP）或小牛肠（）或小牛肠（calf intestinal calf i

22、ntestinal alkaline phosphatase CIPalkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去），该酶用于脱去DNADNA（RNARNA）55末端的磷酸根，使末端的磷酸根，使5-P5-P成为成为5-OH5-OH，该过程称核酸分子的，该过程称核酸分子的脱磷酸作用脱磷酸作用。当。当需要需要55端同位素标记或为了避免端同位素标记或为了避免DNADNA片段自身片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。S1S1核酸酶：核酸酶：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNADNA，用于将粘性末端水解成平末端及，用于

23、将粘性末端水解成平末端及cDNAcDNA发夹式结构的处理。发夹式结构的处理。反转录酶（反转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以这类酶来自于反转录病毒，它可以RNARNA为模板，催化合成。目前常为模板，催化合成。目前常用的有禽源（用的有禽源（AMVAMV）及鼠源（）及鼠源（M-MLVM-MLV）反转录酶两种。反转录酶两种。体外连接的三种方式：体外连接的三种方式：1.1.用用连接酶连接酶连接具有互补粘性末端的连接具有互补粘性末端的DNADNA片断片断 2.2.用用连接酶连接酶将平末端的将平末端的DNADNA片断连

24、接；片断连接；或是用或是用末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的给具平末端的DNADNA片断加上片断加上poly(A)-poly(T)poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用尾巴之后，再用连接酶连接。连接酶连接。3.3.先在先在DNADNA片断末端加上化学合成的衔接物或接片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用连接酶连接头，形成粘性末端后，再用连接酶连接 连接酶：连接酶：能够将能够将DNADNA链上彼此相邻的链上彼此相邻的3-3-羟基（羟基（OH OH）和）和5-5-磷酸基团（磷酸基团（-P-P），在），在NAD+NAD+或或ATPATP供能的作用下，形成磷酸

25、二酯键。供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接只能连接缺口缺口（nicknick），不能连接），不能连接裂口裂口（gapgap）。而且被连接的）。而且被连接的DNADNA链必须是双链必须是双螺旋螺旋DNADNA分子的一部分。分子的一部分。酶AMP（腺苷磷酸）磷酸酰胺键DNADNA的腺苷酸复合物的腺苷酸复合物3-OH3-OH对对P P原子作亲核攻击原子作亲核攻击 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键连接酶的作用机理连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸此反应是由焦磷酸(ppi)(ppi)的水解作用激发的的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键需要花费两个高能磷酸键（赖氨酸残基）连接酶的来源连接酶的来源 1.DN

26、A 1.DNA连接酶：连接酶：大肠杆菌染色体编码的大肠杆菌染色体编码的 2.T 2.T4 4 DNA DNA连接酶：大肠杆菌连接酶：大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA编码的编码的 DNA DNA连接酶连接酶 NAD+NAD+T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶 ATPATP连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）该酶常从该酶常从噬菌体的受感细胞中提取，是由噬菌体的受感细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二连接酶。它可催化中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键

27、的形式结合脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。起来。DNADNA连连接接酶酶对对具具有有粘粘性性末末端端的的DNADNA分分子子经经退退火火后后能能很很好好地地连连接接，对对平平末末端端的的DNADNA分分子子也也可可以以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。影响连接酶作用的因素影响连接酶作用的因素 1.1.反应温度：反应温度：连接缺口的温度：连接缺口的温度：3737度度 连接连接粘性末端粘性末端的最佳温度：的最佳温度：4 41515度度 2.2.连接酶的用量：连接酶的用量：平末端平末端DNADNA分子的连接反应中，最适分子的连接反

28、应中，最适1 12 2个单位。个单位。粘性末端粘性末端DNADNA片断之间的连接，酶浓度片断之间的连接，酶浓度0.10.1个单位。个单位。ATP ATP的用量的用量10mol1mmol/L10mol1mmol/L之间之间 3.3.提高外源片断与载体的浓度的比值，（提高外源片断与载体的浓度的比值，（10102020倍）倍）粘性末端粘性末端DANDAN片断的连接片断的连接 由于具粘性末端的载体易发生自连。由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的对载体的55末端进行处理，用细菌的或小末端进行处理，用细菌的或小牛肠的牛肠的碱性磷酸酶碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不移去磷酸基团，使载体不能自连。能自连。

29、而外源片断的而外源片断的5-P5-P能与载体的能与载体的3-OH3-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体每一个连接位点中载体DNADNA只有一条链与外只有一条链与外源片断相连，失去源片断相连，失去5-P5-P的链不能进行连接，的链不能进行连接，形成形成3-OH 3-OH 和和5-OH 5-OH 的缺口。的缺口。平末端平末端DNADNA片断的连接片断的连接 1.T4DNA 1.T4DNA连接酶连接酶 2.2.用用末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚给平末端加上同聚物尾巴之后，再用物尾巴之后，再用DNADNA连接酶连接

30、。连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法物法和接头连接法 同聚物加尾法同聚物加尾法用用5 5 末端特异的核酸外切酶处理末端特异的核酸外切酶处理DNADNA片断片断在在A A和和B B分别中加入分别中加入dATPdATP和和dTTPdTTP同聚物尾巴同聚物尾巴10401040个碱基个碱基 同聚物加尾法或同聚物加尾法或T4T4连接酶的平连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片酶作特异性的切割，获得插入片断进行进一步的研究。断进行进一步的研究。衔接物连接法衔接物连接法 平末端的另一种处理方

31、式是利用衔接物平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linkerlinker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子是一种人工合成的小分子DNADNA，约，约10201020个核苷个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：切位点的回文结构。如：CCGGATCCGG CCGGATCCGG GGCCTAGGCC GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端将衔接物分子与平末端DNADNA分子连接，再用限分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。制性核酸内切酶酶切，

32、便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。Hpa II Hpa IIBamH I 或Sau3A 衔接物（衔接物（linkerlinker）是指用化学方法合成是指用化学方法合成的一段由的一段由10101212个核苷酸组成、具有个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。的双链寡核苷酸短片段。双衔接物：双衔接物：可以实现定向克隆，防止可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。也比较方便。衔接物连接法衔接物连接法双衔接物

33、连接双衔接物连接法的基本程序法的基本程序cDNA链的合成链的合成通过通过DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链加入加入Sal I衔接物衔接物S I核酸酶作用后的末端单链突出序列，核酸酶作用后的末端单链突出序列，由由Klenow补齐，加入第二衔接物补齐，加入第二衔接物Ecol I 在用在用DNADNA衔接物连接法时，如果待克衔接物连接法时，如果待克隆隆DNADNA的片断或基因内部，含有与所加衔的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。切断。DNADNA接头（接

34、头（adapteradapter）连接法：）连接法：1978 1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞的教授吴瑞 博士发明的。博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对接物一样的二聚体分子。对DNADNA接头分子末接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端端，进行必要的修饰。移走粘性末端5-P5-P，暴露出暴露出5-O

35、H5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。，不能产生稳定的二聚体分子。DNA接头连接法接头连接法 热稳定的连接热稳定的连接 从嗜热从嗜热高温高温方线菌的菌株中分离出来的。方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。用的一种核酸酶。1.1.寡核苷酸连接测定寡核苷酸连接测定2.2.（oligonucletide ligation assay,OLAoligonucletide ligation assay,OLA）3.3.用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNADNA杂杂交，探针在靶交，探针在靶

36、 DNA DNA分子的位置是相邻的。分子的位置是相邻的。2.2.连接酶链式反应（连接酶链式反应（lingase chain reaction,LCRlingase chain reaction,LCR）；）；也叫连接扩增反应（也叫连接扩增反应（lingase amplication lingase amplication reactionreaction）3.3.用寡核苷酸探针通过用寡核苷酸探针通过DNADNA连接酶的作用扩增连接酶的作用扩增已知序列的靶已知序列的靶DNADNA的方法。需要的方法。需要4 4种引物，种引物，寡核苷酸连接测定寡核苷酸连接测定 AGTGACCT TCACTGGA A

37、 G T G A C C T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A G T G A C C T A C C T A G T G A C C T A C C T 待扩增的待扩增的DNA片断片断PPBBDD地高辛配基地高辛配基生物素生物素磷酸磷酸BBBBDDPP阳性信号阳性信号无信号无信号酶抗生素蛋白酶抗生素蛋白由于碱基错配不能形成磷酸二酯键由于碱基错配不能形成磷酸二酯键检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性LCR：ligase chain reaction，连接接酶链式反式反应。样品样

38、品DNA、探针、探针(4)94度变性度变性DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 常用的常用的DNADNA聚合酶：聚合酶：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶、聚合酶、大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶的聚合酶的KlenowKlenow大片断酶、大片断酶、T T4 4DNADNA聚合酶、聚合酶、T T7 7DNADNA聚合酶、聚合酶、反转录酶等。反转录酶等。共同点：共同点：把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNADNA分子引物链的分子引物链的3-OH3-OH末端，催化核末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况

39、。上解离的情况。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶（聚合酶（PolPol）、）、DNA DNA聚合酶聚合酶（Pol Pol ）、）、DNA DNA聚合酶聚合酶 （Pol Pol ）、）、PolPol和和Pol Pol 的主要功能参与的主要功能参与DNADNA的合成；的合成；Pol Pol 的功能同的功能同DNADNA的复制有关；的复制有关；Pol Pol同同DNADNA分子克隆的关系最为密切。分子克隆的关系最为密切。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶：聚合酶：19571957年，美国的生物学家年，美国的生物学家A.KornbergA.Kornberg首首次证实，在大肠

40、杆菌提取物中存在一种次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNADNA聚合酶，即现在所说的聚合酶，即现在所说的DNADNA聚合酶。由聚合酶。由polpol基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为量为1091091000dal1000dal。DNADNA聚合酶，可以被蛋白酶切割成两聚合酶，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的个片断，一个具有全部的3 53 5的外切酶的外切酶活性和活性和5 3 5 3 的聚合酶活性，另一个具有的聚合酶活性，另一个具有全部全部 5 3 5 3的外切酶活性。的外切酶活性。DNADNA聚合酶的酶活性：聚合酶的酶活性：1.5 31.5 3

41、的聚合酶活性；的聚合酶活性；2.5 3 2.5 3的外切酶活性；的外切酶活性；3.3 5 3.3 5的外切酶活性（较低）。的外切酶活性（较低）。DNADNA聚合酶发挥作用的条件：聚合酶发挥作用的条件：1 1、底物：、底物：四种脱氧核苷四种脱氧核苷5-5-三磷酸三磷酸（dNTPdNTP）；）；2 2、MgMg离子离子；3 3、带有、带有3-OH3-OH游离基团的引物链；游离基团的引物链；4 4、DNADNA模板：单链，双链（模板：单链，双链（糖糖-磷酸主键上有一个磷酸主键上有一个 或多个断裂或多个断裂）。）。DNADNA聚合酶聚合酶5 35 3的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 1 1、5 3 5

42、 3的外切酶活性，所切割的的外切酶活性，所切割的DNADNA链必须是位于双螺旋的区段上；链必须是位于双螺旋的区段上；2 2、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距可以是在距55末端数个核苷酸远的一个键末端数个核苷酸远的一个键上发生；上发生；3 3、DNADNA的合成可以增强的合成可以增强5 35 3的核酸的核酸外切酶活性；外切酶活性；4 4、5 3 5 3核酸外切酶的活性位点同聚核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及合作用的活性位点以及3 53 5的水解作用的水解作用位点是分开的。位点是分开的。DNADNA聚合酶的聚合酶的3 5 3 5 核酸外切酶活

43、性核酸外切酶活性 能催化能催化DNADNA链发生水解作用，从链发生水解作用，从DNADNA链链3-OH3-OH末端开始向末端开始向55的方向水解的方向水解DNADNA，并释，并释放出单核苷酸分子。放出单核苷酸分子。对酶活的影响：对酶活的影响：反应物中缺乏反应物中缺乏dNTPsdNTPs时，大肠杆菌时，大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶的酶的3 53 5核酸外切酶活性，将会发挥作用。核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的但对于底物是双链的DNADNA，在具有，在具有dNTPsdNTPs时，时，这种降解活性将会被这种降解活性将会被5 3 5 3 的聚合酶活性所的聚合酶活性所抑制抑制。DNAD

44、NA聚合酶在分子克隆中的主要用途：聚合酶在分子克隆中的主要用途：通过通过DNADNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的放射性标记的DNADNA探针。探针。DNADNA缺口转移（缺口转移（nick translationnick translation）在在DNADNA分子的单链缺口上，分子的单链缺口上，DNADNA聚合酶的聚合酶的5 5 33核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的酶活性从缺口的55一侧移去一个一侧移去一个55核苷酸之后，聚核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的合酶作用就会在

45、缺口的33一侧补上一个新的核苷酸，一侧补上一个新的核苷酸，但但polpol不能在不能在3-OH3-OH和和5-P5-P之间形成一个键，随着之间形成一个键，随着55一侧的核苷酸不断移去，一侧的核苷酸不断移去，3 3一侧的核苷酸又按序一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着列增补，缺口便沿着DNADNA分子合成的方向移动。分子合成的方向移动。DNADNA杂交探针的制备杂交探针的制备 典型的反应体系是。在典型的反应体系是。在25l25l总体积中总体积中含有含有1 g1 g纯化的特定纯化的特定DNADNA片断，并加入片断，并加入适量的适量的DnaseDnase、PolPol、-32p-dNTPs-32p-

46、dNTPs和未标记的和未标记的dNTPsdNTPs。DnaseDnase：造成：造成DNADNA分子的断裂或缺口；分子的断裂或缺口；PolPol ：进行缺口转移，使反应混合物进行缺口转移，使反应混合物中的中的32p32p标记的核苷酸取代原有的未标记标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。的核苷酸，最终从头到尾都被标记。dNTP dNTP 对对PolPol酶活性的影响酶活性的影响 在低浓度在低浓度dNTPsdNTPs的条件下，的条件下，Pol Pol具具有良好的活性有良好的活性，提高提高dNTPsdNTPs浓度时，浓度时，Pol Pol则能够更有效的合成则能够更有效的合成DN

47、ADNA。低浓度的低浓度的 3232p-dNTPsp-dNTPs（2 mol/L2 mol/L）和高浓度的和高浓度的dNTPsdNTPs（20 mol/L 20 mol/L）一般希望有一般希望有30%30%左右的左右的3232p-dNTPsp-dNTPs参参入入DNADNA链（链（Dnase Dnase数量）。数量）。KlenowKlenow片断与片断与DNADNA末端标记末端标记 1 1、Klenow Klenow片断：是由大肠杆菌片断：是由大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为来的分子量为76761000dal100

48、0dal的大片断分子。的大片断分子。仍具有仍具有5 35 3的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 5 3 5 的外切酶活性，失去了全酶的的外切酶活性，失去了全酶的5 3 5 3 外外切酶活性。切酶活性。KlenowKlenow片断的主要用途：片断的主要用途：1 1、修补经限制酶消化的、修补经限制酶消化的DNADNA所形成的所形成的33隐蔽末端；隐蔽末端；2 2、标记、标记DNADNA片断的末端；片断的末端；3 3、cDNAcDNA克隆的第二链克隆的第二链cDNAcDNA的合成；的合成；4 4、DNADNA序列的测定。序列的测定。DNADNA片断末端标记：片断末端标记：具有具有 3 3隐蔽末端的带标记

49、得的隐蔽末端的带标记得的DNADNA片断片断 5GATCT3 5GATCT3 3 A5 3 A5在反应物中加入在反应物中加入KlenowKlenow聚合酶聚合酶-32p-d-32p-dG GTP,TP,一道温育后生成：一道温育后生成：5GATCT3 5GATCT3 3 3 32p32p GA5 GA5 或是同时加入或是同时加入-32p-d-32p-dA ATPTP dGTP dGTP5GATCT35GATCT33332p32p AGA5 AGA5 DNADNA片断末端标记可以作为用凝片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的为被标记的

50、DNADNA片断是同它们的摩尔浓片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程产生的大小所以在限制酶消化过程产生的大小DNADNA片断都得到了同等程度的标记。片断都得到了同等程度的标记。不能够有效的标记带有不能够有效的标记带有55突出末端突出末端的的DNADNA分子。分子。T T4 4DNADNA聚合酶和聚合酶和 取代合成法标记取代合成法标记DNADNA片断片断 1 1、从、从T4T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的特殊的DNADNA聚合酶。具有聚合酶。具有5 35 3的聚合酶活