第二章预处理技术优秀课件.ppt

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1、第二章预处理技术第1页，本讲稿共96页2.1 概述生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤：动物组织和器官动物组织和器官要先除去结缔组织、脂肪等要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，然后绞碎，选择适当的溶剂形成非活性部分，然后绞碎，选择适当的溶剂形成细胞悬液。细胞悬液。植物组织和器官植物组织和器官要先去壳、除脂，再粉碎，要先去壳、除脂，再粉碎，选择适当的溶剂形成细胞悬液。选择适当的溶剂形成细胞悬液。发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及制成发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及制成的细胞的细胞悬液悬液等则根据目标产物所处位置不同等则根据目标产物所处位置不同进行相应的处理。进行相应的处理。第2页，本讲稿共9

2、6页 发酵液预处理的目的和内容发酵液预处理的目的和内容 相对纯化。相对纯化。发酵液预处理的主要目的：*发酵液预处理的主要包括：改变发酵液改变发酵液(培养液培养液)的物理性质，以利于的物理性质，以利于固液分离。主要方法有加热、调整固液分离。主要方法有加热、调整pH、凝、凝聚和絮凝。聚和絮凝。去除发酵液去除发酵液(培养液培养液)中部分杂质，以利于提取中部分杂质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。和精制后继各工序的顺利进行。发酵液过滤特性的改变；发酵液过滤特性的改变；第3页，本讲稿共96页2.1 发酵液过滤特性的 改变与相对纯化这些特性使得发酵液的过滤与离心相当困难微生物发酵液的特性为：发酵产物

3、浓度较低，悬浮液中大部分是水；发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响成分复杂，杂质较多。成分复杂，杂质较多。第4页，本讲稿共96页一、改善发酵液过滤特性的方法：1.降低液体黏度2.调整pH3.加入反应剂4.加入助滤剂5.凝聚6.絮凝第5页，本讲稿共96页 常用的方法有加水

4、稀释法和常用的方法有加水稀释法和加热法加热法。加水。加水稀释法会加大后续过程的处理任务。稀释法会加大后续过程的处理任务。1.降低液体黏度注意事项：严格控制加热温度与时间。首先，加热的温度必须控制在不影响目的产物活性变质的范围内；其次，温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。第6页，本讲稿共96页 此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一，此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一，方法简单有效、成本低廉。方法简单有效、成本低廉。如利用酸碱性来如利用酸碱性来调节调节pH值使蛋白质等两性物质达到值使蛋白质等两性物质达到等电点等电点得以除去

5、。又如过滤中，发酵液中的大得以除去。又如过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。染。2.调整pH第7页，本讲稿共96页3.加入反应剂加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶体物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。第8页，本讲稿共96页助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量对过滤速度影响很大。对过滤速度影响很大。4

6、.加入助滤剂助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。常有的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液，也可两种方法同时使用。第9页，本讲稿共96页在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。二、发酵液的相对纯化1.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）2.杂蛋白在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力；在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生

7、乳化现象，使两相分离不清；第10页，本讲稿共96页（一）高价无机离子的去除方法2.Mg2+三聚磷酸钠三聚磷酸钠(Na5P3P10)形成形成 三聚磷酸钠镁可溶性络合物三聚磷酸钠镁可溶性络合物 1.Ca2+草酸、草酸、草酸钠草酸钠形成草酸钙沉淀形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）（注意回收草酸）3.Fe2+黄血盐黄血盐(K4Fe(CN)6)普鲁士蓝普鲁士蓝 沉淀沉淀第11页，本讲稿共96页（二）杂蛋白的去除方法1.沉淀法2.变性法 3.吸附法第12页，本讲稿共96页l在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；l在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子

8、，如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和Pb+等形成沉淀。1.沉淀法第13页，本讲稿共96页2.变性法 加热，大幅度调节pH值，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处a.加热法只适合于对热较稳定的目的产物；b.极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；c.有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。第14页，本讲稿共96页加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同

9、作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；质；在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法第15页，本讲稿共96页n采用凝聚和絮凝技术采用凝聚和絮凝技术能有效改变能有效改变细胞、细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态分散状态，使其使其聚结成较大的颗粒聚结成较大的颗粒，便于提高过滤，便于提高过滤速率。常用于菌体细小而且粘度大的发速

10、率。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。酵液的预处理。第三节 凝聚与絮凝第16页，本讲稿共96页n凝聚凝聚是指在某些电解质作用下，破是指在某些电解质作用下，破坏细胞，菌体和蛋白质等胶体粒子的分坏细胞，菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。散状态，使胶体粒子聚集的过程。一、凝聚概念第17页，本讲稿共96页n原理：原理：发酵液发酵液(培养液培养液)中细胞、菌体或蛋白质等中细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面都带有同种胶体粒子的表面都带有同种电荷电荷，使得这些胶体粒子，使得这些胶体粒子之间相互排斥，保持一定距离而不互相凝聚。另外，之间相互排斥，保持一定距离而不互相凝聚。另外，这

11、些胶体粒子和水有高度的亲和性，其表面很容易吸这些胶体粒子和水有高度的亲和性，其表面很容易吸住水分，形成一层住水分，形成一层水膜水膜，从而使胶体粒子呈分散状，从而使胶体粒子呈分散状态。在发酵液态。在发酵液(培养液培养液)中加入电解质，就能中加入电解质，就能中和中和胶胶体粒子的体粒子的电性电性，夺取胶体粒子表面的水分子，夺取胶体粒子表面的水分子，破破坏坏其表面的其表面的水膜水膜，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚集起来。集起来。一、凝聚第18页，本讲稿共96页n阳离子对带负电荷的凝胶凝聚能力的次序为：阳离子对带负电荷的凝胶凝聚能力的次序为：Al3+Fe 3+H+Ca2+Mg

12、2+K+Na+Li+无机盐类：金属氧化物类：Al2(SO4)3.18H2O(明矾)、AlCl3.6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等(2)常用的凝聚剂第19页，本讲稿共96页n絮絮凝凝指指使使用用絮絮凝凝剂剂(通通常常是是天天然然或或合合成成的的大大相相对对分分子子质质量量物物质质)，在在悬悬浮浮离离子子之之间间产产生生架架桥桥作作用用而而使使胶胶粒粒形形成成粗粗大的絮凝团的过程。大的絮凝团的过程。二、絮凝概念第20页，本讲稿共96页n絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千

13、万以上，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如）或阳离子（如-NH2）基团以及）基团以及不带电荷的非离子型基团。不带电荷的非离子型基团。n它们通过静电引力、范德华引力或氢键的它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生的胶粒表面上，产生桥架连接桥架连接时，就形成时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作

14、用。了较大的絮团，这就是絮凝作用。二、絮凝第21页，本讲稿共96页絮凝作用示意图第22页，本讲稿共96页必须具有长链的线性结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子质量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合；2.对絮凝剂化学结构的一般要求第23页，本讲稿共96页1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。工业上使用的絮凝剂可分为三类：3.常用的絮凝剂第24页，本讲稿共96页目

15、前最常见的高分子聚合物絮凝剂:有机合成的聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：非离子型、阴离子型（含有羧基）阳离子型（含有胺基）3.常用的絮凝剂第25页，本讲稿共96页聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点l用量少，一般以用量少，一般以mg/L计量；计量；l絮凝体粗大，分离效果好；絮凝体粗大，分离效果好；l絮凝速度快；絮凝速度快；l种类多，适用范围广。种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点u存在一定的毒性，特别是阳离子型聚存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。谨慎。第26页，本讲稿共96页4.絮凝的影响

16、因素絮凝的影响因素l搅拌速度和时间：搅拌速度和时间：初期高速，接着应延长初期高速，接着应延长搅拌时间，降低搅拌速度。搅拌时间，降低搅拌速度。l絮凝体的浓度：最佳添加量往往需通过实验确定l溶液的pH：通过实验确定l絮凝剂的相对分子质量：要适当第27页，本讲稿共96页淀粉酶发酵液中第28页，本讲稿共96页n对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。三、混凝n对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；第29页，本讲稿共96页第四节第四节 细胞破碎细胞破碎一、细

17、胞壁结构和特点二、细胞破碎率效果的检验三、细胞破碎的方法四、选择破碎方法的依据五、破碎技术的发展方向第30页，本讲稿共96页细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。概念第31页，本讲稿共96页微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质(6-8%）脂类(8.5-13.5%)多聚糖

18、（80-90%）脂类蛋白质一、细胞壁的结构和特点第32页，本讲稿共96页u由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。1.微生物细胞壁的化学组成和结构u细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大；u酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；第33页，本讲稿共96页2.植物细胞壁的化学组成和结构u成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁，次生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成时，细胞不再增大。u初生壁与次生壁的主要化学成分均为纤维素。纤维素分子又可进一步组装成微纤丝，微纤丝再交织成网状，就构成细胞壁的基本骨

19、架。第34页，本讲稿共96页u在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞壁的组成最重要，其次是细胞壁的结构。3.细胞壁的结构与细胞的破碎u在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。细胞个体小、呈球形、壁厚、聚合交联程度高则难破碎。第35页，本讲稿共96页二、细胞破碎效果的检查 破碎率定义:被破碎的细胞的数量占原始细胞数量的百分数，即其中N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接测定法、目的产物测定法和测定导电率得到。第36页，本讲稿共96页1.直接测定法直接测定法显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把破碎的显微镜计数相对快速简单

20、，采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。细胞与未破碎的细胞区别开来。方法：样本适当稀释后，通过平板计数技术或在血球计数板上用显微镜观察来实现染色细胞的技术。平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，误差大；细胞聚集时，不利计数。第37页，本讲稿共96页2.目标产物测定法目标产物测定法Rm：理论最大值，R：实验测得值。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。破碎率所获得的标准数值比较，

21、计算其破碎率。第38页，本讲稿共96页3.测定导电率测定导电率细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。增加而呈线性增加。导电率的大小取决于微生物的种类、处理的条件、细胞的浓度、温度和悬浮液中原电介质的含量等，因此，正式测定前，应预先用其它方法测定标准曲线。第39页，本讲稿共96页分 类作用机理适应性物理破碎高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难

22、超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用反复冻融法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜的渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合化学破碎酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差三、细胞破碎的方法（按细胞所受作用）第40页，本讲稿共96页高压匀浆法珠磨法超声破碎法渗透压法反复冻融法干燥法X-pres

23、s法1.物理破碎第41页，本讲稿共96页(1)高压匀浆法（高压匀浆法（High-pressure homogenization）大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。原理：第42页，本讲稿共96页进口出口第43页，本讲稿共96页高压均浆法中影响细胞破碎的因素主要有高压均浆法中影响细胞破碎的因素主要有高压均浆法中影响细胞破碎的因素主要有高压均浆法中影响细胞破碎的因素主要

24、有压力、压力、压力、压力、循环操作次数和温度循环操作次数和温度循环操作次数和温度循环操作次数和温度。一般来说，增大压力和增一般来说，增大压力和增一般来说，增大压力和增一般来说，增大压力和增加破碎次数可提高破碎率，但当压力增大到一定加破碎次数可提高破碎率，但当压力增大到一定加破碎次数可提高破碎率，但当压力增大到一定加破碎次数可提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对均浆器的磨损较大，工业生产中常用程度后对均浆器的磨损较大，工业生产中常用程度后对均浆器的磨损较大，工业生产中常用程度后对均浆器的磨损较大，工业生产中常用555570MPa70MPa的压力。对于酵母等难破碎的及高浓的压力。对于酵母等难破碎

25、的及高浓的压力。对于酵母等难破碎的及高浓的压力。对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用度的细胞，常采用度的细胞，常采用度的细胞，常采用多次循环多次循环多次循环多次循环的操作方法。的操作方法。的操作方法。的操作方法。破碎率破碎率破碎率破碎率随温度的增加而增加随温度的增加而增加随温度的增加而增加随温度的增加而增加，但高温破碎只适用于非热变，但高温破碎只适用于非热变，但高温破碎只适用于非热变，但高温破碎只适用于非热变性产物。性产物。性产物。性产物。高压匀浆法中影响细胞破碎的因素高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:第44页，本讲稿共96页不宜采用高压匀浆法的微生物：不宜采用高压匀浆法的微生物：n易造成堵

26、塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，n较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，n含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）易损伤匀浆阀）适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。第45页，本讲稿共96页进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。(2)珠磨法（Bead mill）工作原理：工作原理：第4

27、6页，本讲稿共96页卧式第47页，本讲稿共96页n实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；n中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；n在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。第48页，本讲稿共96页影响细胞破碎的因素影响细胞破碎的因素nb.珠体的装量珠体的装量na.珠体的大小珠体的大小nc.搅拌速度搅拌速度nd.操作温度操作温度ne.被处理细胞的特性被处理细胞的特性 实验室规模，珠径实验室规模，珠径

28、0.2mm，工业，工业规模珠径大于规模珠径大于0.4mm8090适当适当540珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80以下以下第49页，本讲稿共96页n其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。3.超声破碎法（Ultrasonication）n超生波破碎细胞时的频率一般为超生波破碎细胞时的频率一般为1520 kHz，功率为，功率为100250W，可分为，可分为槽槽式和式和探头直接插入介质式探头直接插入介质式两种型式。两种型式。第50页，本讲稿共96页第51页，本讲稿共96页（3）超声波破碎法）超声波破碎法n影响超生波破碎的因素主要有超声波的声强、频率、破碎时间、介质的离子强度

29、、pH、菌体的浓度和种类。n一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20左右。第52页，本讲稿共96页（3）超声波破碎法）超声波破碎法n超声波破碎法在超声波破碎法在实验室和小规模生产实验室和小规模生产中中应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷却到却到05，并且还应在夹套中连续通，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行入冷却剂进行冷却冷却。n另外，超声波产生的另外，超声波产生的化学自由基团化学自由基团能使能使某些敏感性活性物质某些敏感性活性物质失活失活。可以通过添。可以通过添加自由基清洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，加自由基清

30、洗剂如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。或用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。第53页，本讲稿共96页将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。（4）渗透压冲击法（Osmotic pressure）仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。第54页，本讲稿共96页将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细

31、胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。（5）反复冻融法适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。第55页，本讲稿共96页使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。（6）干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥气流干燥气流干燥主要适用于酵母菌主要适用于酵母菌，一般在一般在2530的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥真空干燥多用于细菌多用于细菌；冷冻干；冷冻干燥燥适用于较不稳定的物质适用于较不稳定的物质。第56页，本讲稿共96页此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至此法是将浓缩的菌体

32、悬浮液冷却至-25形形成冰晶体，利用成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶使冷冻细胞从高压阀小孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而破碎。破碎。（7）X-press法该法主要用于实验室，具有使用范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。不适用于对冷冻敏感的物质。第57页，本讲稿共96页酶溶法化学试剂破碎法外加酶法自溶法表面活性物质EDTA螯合剂有机溶剂变性剂2.化学破碎（Chemical permeation）第58页，本讲稿共96页（1）酶溶法（Enzymatic Lys

33、is）外加酶法外加酶法常用的溶酶G+溶菌酶、适量抑制剂溶菌酶、适量抑制剂G-溶菌酶、溶菌酶、EDTA放线菌放线菌 溶菌酶溶菌酶酵母菌酵母菌 -葡聚糖酶葡聚糖酶霉菌霉菌 几丁质酶、几丁质酶、植物植物 纤维素酶、半纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶细胞壁溶解酶是几种酶的复合物第59页，本讲稿共96页选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。酶溶法的优点：酶溶法的缺点：第60页，本讲稿共96页u缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增

34、大，过滤速度下降。（2）自溶法（Autolysis）u诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。u影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。第61页，本讲稿共96页某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。（2）化学试剂破碎法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。

35、第62页，本讲稿共96页如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。第63页，本讲稿共96页处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。EDTA螯合剂

36、第64页，本讲稿共96页能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。有机溶剂变性剂盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。第65页，本讲稿共96页l通用性差；l时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%l有些化学试剂有毒。化学法的优点：缺点：l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。

37、第66页，本讲稿共96页细胞破碎方法细胞破碎方法（按是否使用外加作用力）（按是否使用外加作用力）分 类作 用 机 理适 应 性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性

38、差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活第67页，本讲稿共96页细胞破碎方法：细胞破碎方法：机械法非机械法缺点：固液分离较困难。优点：设备通用性强、破碎率高、操作时间短、成本低、大多数方法适于大规模生产。缺点：破碎率低、耗时、成本高、一般适合小规模生产。优点：固液分离容易。第68页，本讲稿共96页选择破碎方法时，需要考虑下列因素选择破碎方法时，需要考虑下列因素：四、选择破碎方法的依据1.处理量的大小2.细胞壁 的强度和结构3.目标产物对破碎条件的敏感性4.破碎后固

39、液分离的难易程度适宜的操作条件应从高的产物释放率、低的能耗和便于后步提取这三方面权衡。第69页，本讲稿共96页五、破碎技术的发展方向1.多种破碎方法相结合2.与上游技术相结合培养过程控制3.与下游技术相结合寄主细胞的选择包含体的组成耐高温产品的基因表达克隆噬菌体溶解基因第70页，本讲稿共96页第五节第五节 离心技术离心技术第71页，本讲稿共96页离心分离n离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心力场中使不同密度的固存在差异，在离心力场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。体颗粒加速沉降的分离过程。优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好。缺

40、点：设备投资高、能耗大。第72页，本讲稿共96页一、离心分离的基本原理n当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转的速动物体就受到离心力的作用。旋转的速度越高，运动物体所受到的离心力越大。度越高，运动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，在相同转速条件下，行高速水平旋转，在相同转速条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。质会以不同的速率沉降。第73页，本讲稿共96页定义：颗粒在单位离心力场中移动的距离。相对离心力

41、（Relative centrifugal force）（RCF）是指在离心场中作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数。相对离心力：相对离心力：RCF=r2/g =2n2r/900g 1.离心力与相对离心力第74页，本讲稿共96页定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。沉降系数是以时间表示的。s=2.303(lgx2-lgx1)/2(t2-t1)2.沉降系数（sedimentation coefficient，s）定义：在离心力下，单位时间内物质运动的距离。3.沉降速度4.沉降时间t2-t1=lnr2/r1/s2 第75页，本讲稿共96页定义：离心分类机转鼓内的悬浮液或乳浊液在离心场中所受的

42、离心力与其重力的比值，即离心加速度与重力加速度的比值。5.分离因数Fr=R2/g=2Rn2/900g 分离分离时，要根据所分离物质以及杂质的大小、密度和特性的不同选择适当的离心机、离心方法和离心条件。第76页，本讲稿共96页二、离心分离纯化的分法二、离心分离纯化的分法差速离心法速率区带离心法等密度离心法第77页，本讲稿共96页（1）差速离心法）差速离心法n通过控制通过控制不同的离心力和离心时间不同的离心力和离心时间，使，使沉沉降速度不同的颗粒降速度不同的颗粒逐级分离的方法。操作逐级分离的方法。操作时选用悬浮液来进行分离，先选择好离心时选用悬浮液来进行分离，先选择好离心力和离心时间，使悬浮液中最

43、大的颗粒先力和离心时间，使悬浮液中最大的颗粒先沉淀，取出上情液，然后加大离心力再进沉淀，取出上情液，然后加大离心力再进行分离，沉淀出较小的颗粒，如此多次分行分离，沉淀出较小的颗粒，如此多次分离，达到逐级分离的目的。离，达到逐级分离的目的。第78页，本讲稿共96页（1）差速离心法）差速离心法n差速离心法的分辨率不高，沉降系数差速离心法的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不易分在同一个数量级内的各种粒子不易分开，常用于粗制品的提取，如细胞均开，常用于粗制品的提取，如细胞均浆中细胞器的分离。浆中细胞器的分离。第79页，本讲稿共96页第80页，本讲稿共96页（2）速率区带离心法）速率区带离

44、心法n也称一般密度梯度离心法，是在离心管中事先加入也称一般密度梯度离心法，是在离心管中事先加入某种低分子溶液某种低分子溶液(蔗糖、甘油等蔗糖、甘油等)，调配好，调配好密度梯度密度梯度，在密度梯度溶液得顶部加待处理得样品，然在密度梯度溶液得顶部加待处理得样品，然后离心，使沉降系数比较接近得物质得以分后离心，使沉降系数比较接近得物质得以分离得一种区带分离方法。离得一种区带分离方法。n梯度介质不与目的组分反应，不引起分离组分得梯度介质不与目的组分反应，不引起分离组分得变性、失活。用于形成密度梯度介质很多，较常变性、失活。用于形成密度梯度介质很多，较常用得是蔗糖、甘油、硅胶等。用得是蔗糖、甘油、硅胶等

45、。第81页，本讲稿共96页步骤：步骤：1)在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的密度从离心管顶部至底部逐步增加（正密度从离心管顶部至底部逐步增加（正 梯度）梯度）2)将所需分离的样品小心地加至密度梯度将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成 一负梯度。一负梯度。3)由于不同大小的粒子在离心力作用下梯由于不同大小的粒子在离心力作用下梯度中移动的速度不一样，所有经过离心后，度中移动的速度不一样，所有经过离心后，会形成几条分开的样品区带。会形成几条分开的样品区带。第82页，本讲稿共96页速率区带离心法第83页

46、，本讲稿共96页（3）等密度离心法）等密度离心法n是欲分离的物质颗粒的密度范围在离心是欲分离的物质颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同密度的颗粒向上或向下移动，用下，不同密度的颗粒向上或向下移动，直到颗粒的浮力密度与梯度密度相等，直到颗粒的浮力密度与梯度密度相等，形成区带。形成区带。n常用介质一般为常用介质一般为CsCl、KBr、NaI等，等，首先将待分离的样品铺成在梯度液顶上首先将待分离的样品铺成在梯度液顶上或与梯度液均匀混合，然后离心。或与梯度液均匀混合，然后离心。第84页，本讲稿共96页n在分离开始前，样品可与梯度介质混合在在

47、分离开始前，样品可与梯度介质混合在一起，或铺在密度梯度液上面。在离心力一起，或铺在密度梯度液上面。在离心力的作用下，梯度物质在离心管中重的作用下，梯度物质在离心管中重新分布，因而形成了所需要的浓度新分布，因而形成了所需要的浓度(和密度和密度)梯度。同时，样品颗粒，开始时梯度。同时，样品颗粒，开始时就分布在整个管子中的，沉降或悬浮到就分布在整个管子中的，沉降或悬浮到它们的等密度位置上。它们的等密度位置上。步骤：步骤：第85页，本讲稿共96页等密度离心法第86页，本讲稿共96页区别：区别：区带速度离心 等密度梯度离心 通常应用蔗糖 通常应用氯化铯 最大的梯度密度低于最小密度的沉降样品 最大的梯度密

48、度大于密度最大的沉降样品 在最高的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度 使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度第87页，本讲稿共96页1.悬浮液特性悬浮液特性包括悬浮液中固相颗粒的浓度以及固相和液相的特性等。2.乳浊液特性乳浊液特性3.固体颗粒特性固体颗粒特性三、影响离心效果的因素三、影响离心效果的因素液珠直径大、浓度小、黏度小的乳浊液易于分离。颗粒的大小、黏度分布、性质、密度、表面性质等。第88页，本讲稿共96页四、常用的离心分离设备四、常用的离心分离设备n离心沉降设备离心沉降设备根据其离心力大小根据其离心力大小，可分，可分为低速离心机、高速离心机和超离心机。为低速离心机、高速离心机

49、和超离心机。按型式按型式可分为管式、碟片式等，按可分为管式、碟片式等，按作用作用原理不同原理不同可分为过滤式离心机和沉降式可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类离心机两大类。按出渣方式按出渣方式可分为人工可分为人工间歇出渣和自动出渣等方式。间歇出渣和自动出渣等方式。第89页，本讲稿共96页碟片式离心机工作原理碟片式离心机工作原理n当悬浮液在动压头的作用下，经中心管流入高速旋转的当悬浮液在动压头的作用下，经中心管流入高速旋转的碟片之间的间隙时，便产生了惯性离心力，其中密度较碟片之间的间隙时，便产生了惯性离心力，其中密度较大的固体颗粒在离心力作用下向上层碟片的下表面运动，大的固体颗粒在离心力作用下

50、向上层碟片的下表面运动，而后而后 在离心力作用下被向外甩出沿碟片下表面向转子外在离心力作用下被向外甩出沿碟片下表面向转子外围下滑，而液体则由于密度小，在后续液体的推动下沿围下滑，而液体则由于密度小，在后续液体的推动下沿着碟片的隙道向转子中心着碟片的隙道向转子中心 流动然后沿中心轴上升，从套流动然后沿中心轴上升，从套管中排出，达到分离的目的。管中排出，达到分离的目的。n同理对于两种密度不同或互不相溶的液体（如乳浊液）同理对于两种密度不同或互不相溶的液体（如乳浊液）的分离，轻液在后续液体的推动下沿中心向上流动，的分离，轻液在后续液体的推动下沿中心向上流动，重液重液 在离心力作用下沿周围向下流动，从