杨恪鉴超氧化物歧化酶的生产.ppt

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1、路漫漫其悠远少壮不努力，老大徒悲伤 少壮不努力，老大徒悲伤2023/5/19杨恪鉴超氧化物歧化酶的生产路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂一.SOD的概况二.SOD的运用三.SOD的生产四.SOD的活力测定路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂一.SOD 的概况 1.SOD的概念 超氧物歧化酶（Superoxide Dismutase 简称SOD）是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD 被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD 是氧自由基

2、的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。全球118 位科学家发表联合声明：自由基是百病之源，SOD 是健康之本。体内的SOD 活性越高，寿命就越长。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂2、SOD的分类路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂3、作用原理 基本原理 SOD 属于金属蛋白酶，按照结合金属离子种类不同，该酶有以下三种：含铜与锌超氧化物歧化酶（Cu-ZnSOD）、含锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和含铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。三种SOD 都催化超氧化物阴离子自由基，将之歧化为过氧化氢与氧气。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可

3、镂路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂 人体内的自由基 人体内的自由基 在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂 4.SOD的理化性质 3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 3.2 SOD的吸收光谱特性 3.3 SOD稳定性及影响因素路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍

4、，金石可镂5.SOD的作用 它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应，即催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应，从而清除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2，在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用，在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂6 6、测定、测定 超氧化物歧化酶（SOD）的催化底物是O2，一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位。由于O2 自身很不稳定，且不易制备，测定SOD 的方法除少数采用直接法外，一般多为间接法。常用的

5、有：邻苯三酚自氧化法 细胞色素C 还原法（McCord 法）化学发光法 免疫学方法 电泳法路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD 和Fe-SOD 失活，而Mn-SOD 不受影响路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂3.2 SOD的吸收光谱特性 CuZn-SOD 具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280 nm 处并没有最大吸收峰。CuZn-SOD 的可见光最大吸收波长都在680 nm 左右，这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，

6、金石可镂3.3 SOD稳定性及影响因素 PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.39.6间催化性能良好，在pH4.5pH11间能稳定存在。pH3.6时，CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95,其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂二 SOD的运用 1.药物 SOD是一

7、种新型的抗炎症药，根据SOD作用机制和毒性试验，它对治疗因O2-引起的各种 疾病都有一定的疗效。为此，SOD可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外，SOD对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂二 SOD的运用 2.添加剂 国外不少高级化妆品都添加SOD，国内也有数家工厂或公司在开发和生产SOD化妆品，如大宝SOD密，康妮SOD、SOD康舒达霜剂等。SOD作为化妆品添加剂主要有3个优点：（1）有明显的防晒效果（2）可防皮肤衰老，阻止紫褐质（老年斑）的形成（3）有明

8、显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果。国外把SOD作为食品添加剂的例子是加在口香糖和饮料中。我国贵州农学院已开发出刺梨SOD饮料。SOD及修饰过的SOD还可作为外用药膏、眼药及牙膏等的添加剂 路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂二 SOD的运用 3.生化试剂 国外已有数家公司如Sigma公司等出售SOD试剂，国内也有厂家批量生产SOD试剂，如中科院上海生化所东风试剂厂、南京建成生物工程研究所等。此外，SOD有可能作为某些疾病的探针，如郭彦等人认为脑瘤组织线粒体Mn-SOD降低是转化细胞的可靠生化指标之一，并可作为评估脑瘤分化程度的参考。综上所述，随着人们对SOD更广泛深入的研究，

9、不同类型SOD、SOD修饰物及人工有机合成SOD模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂三.SOD的生产 1.SOD酶的提取 称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）15ml，继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。2.去除杂蛋白 上清液中加入0.25倍体积的氯仿乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心15min，放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液 3.SOD酶的沉淀分离 粗酶液在搅拌

10、下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心15min，得到SOD酶沉淀路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂三.SOD的生产 4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量 6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂四、超氧化物歧化酶（SOD）的测定 原理 连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色的中间产物。在自氧化过程

11、的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30-45s 后就与时间呈现性关系。中间产物在325nm 处有强烈的光吸收，在有SOD 存在时能催化生成O2 和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，通过计算就可以求出SOD 的活力。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂 仪器 紫外分光光度计、pH计,离心机路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂 试剂 0.05mol/L 连苯三酚溶液：称取3.15g 连苯三酚用0.01mol/L 盐酸溶液溶解并定容至500ml pH=8.3 Tris-HCl 缓冲溶液 0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液:NH2C(CH2OH)3 12

12、1.14 取12.114g,溶解，定容至100ml 0.1mol/L 盐酸:取8.6(9)ml 浓盐酸，稀释至1000ml 5 0 毫升0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液 19.9_ 毫升0.1mol/L 盐酸混匀并稀释至100 毫升。(保存温度:常温密封避光保存)路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂测定步骤 酶液的制备 称取6g 样品，加于现在冰箱中放置的缓冲液60ml(样品的10 倍，视情况定)，在冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min 离心20min,取上清液用于酶活测定。路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂 连苯三酚自氧化速

13、率的测定 取4.5ml 缓冲液，在25 水浴中保温15min,加入10 连苯三酚液，迅速摇匀 空白：取4.5ml 缓冲液，在25 水浴中保温15min,加入10 缓冲液，迅速摇匀 倒入光径1cm 的比色杯中，在325nm 波长下于恒温池中每隔30s 测A 值一次 计算线形范围内，每1minA 的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂 酶活测定 测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，取1.5ml 缓冲液，在25 水浴中保温15min,加入3ml 酶液，加入10 连苯三酚液，迅速摇匀 空白：取1.5ml 缓冲液，在2

14、5 水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10 缓冲液，迅速摇匀 计算加酶后连苯三酚自氧化速率路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂结果计算 样品酶活单位表示，SOD 酶活单位（U）/g 鲜重 样品酶活单位=式中 酶样品在325nm 处每分钟光密度变化值 V 反应液体积 n 酶液稀释倍数（若酶液足够多，可不稀释即n 为1）路漫漫其悠远锲而不舍，金石可镂 锲而不舍，金石可镂五.SOD使用及生产时的注意事项 1.SOD 的安全性 大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD 对人体无毒性。虽然SOD 是Mr 在30 000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。2.SOD 生产时的注意事项 2.1 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底 2.2 PH 的控制力度很重要，以及在实验中的温度等 2.3 要学会正确使用分光光度计