【高中生物】微生物的培养技术及应用（二）课件 2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、选择性必修3 生物技术与工程2023-05-26 2023-05-26第1 章 发酵工程新课导入 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办？问题探讨美国黄石公园的热泉美国黄石公园的热泉 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR技术）是一种在体外扩增技术）是一种在体外扩增DNADNA片片段的技术，此项技术要求使用段的技术，此项技术要求使用耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶。聚合酶。19731973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出年，科学

2、家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水水生栖热菌生栖热菌，进而提取出耐高温的，进而提取出耐高温的DNADNA聚合酶。这种酶目聚合酶。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCRPCR技术）。技术）。讨论：讨论：1.1.筛选水生栖热菌的思路是什么样的？筛选水生栖热菌的思路是什么样的？2.2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。耐高温 耐高温的酶 的酶耐高温 耐高温生物体 生物体高温环境 高温环境(热泉、火山口 热泉、火山口)寻找

3、寻找寻找 寻找 这是因为水生栖热菌能在这是因为水生栖热菌能在70-8070-80的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。条件下不能生存。思考讨论1.1.在被石油污染的土壤中可以筛选在被石油污染的土壤中可以筛选_微生物。微生物。2.2.在冰川冻土层可以筛选在冰川冻土层可以筛选_微生物。微生物。33.漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是生活污水吗？漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是生活污水吗？_。由以上例子可知，由以上例子可知，某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生

4、物在这种条件下不能生存生物在这种条件下不能生存，因此可以通过这个原理从环境中获得某种，因此可以通过这个原理从环境中获得某种特定种类的微生物。特定种类的微生物。实验室中微生物的筛选，可以应用这个原理吗？实验室中微生物的筛选，可以应用这个原理吗？石油分解菌石油分解菌耐寒耐寒不是不是实验室筛选微生物原理：实验室筛选微生物原理：人为提供人为提供有利于目的菌生长有利于目的菌生长的的条件条件(包括营养、温度和包括营养、温度和pHpH等），等），同时同时抑制或阻止其他微生物的生抑制或阻止其他微生物的生长。长。新课讲解一、选择培养基一、选择培养基1.1.概念：概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同

5、时抑制或阻止其他微生在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基，称为选择培养基。物生长的培养基，称为选择培养基。2.2.选择培养基的选择培养基的选择选择作用：作用：(1)(1)原理：原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。制备培养基。(2)(2)方法方法(思路思路)举例举例：在培养基中加入某种化学物质。在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。加入高浓度

6、的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。改变培养基中的营养成分。改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。自养型微生物。改变微生物的培养条件。改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。思

7、考讨论思考思考讨论讨论 选择培养基配方的设计选择培养基配方的设计 尿素尿素CO(NHCO(NH22)22含氮量高，化学性质稳定，是现代农业含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会施入土壤后，会被土壤中被土壤中的的某某些细菌分解成些细菌分解成NHNH33，再被转化为，再被转化为NONO33-、NHNH44+等被植物吸收等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶脲酶，脲脲酶催化尿素分解产生酶催化尿素分解产生NHNH33，NHNH33可以作为细菌生长的氮源。可以作为细菌生长的氮

8、源。讨论：讨论：1.1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？来，培养基的配方该如何设计？2.2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。发育繁殖。除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。相同。复习巩固1.1.从物理性

9、质来讲，两者属于从物理性质来讲，两者属于_培养基，培养基，判断依据是判断依据是_；该类培养基的主要用途为该类培养基的主要用途为_；2.2.从用途上来讲，培养基二属于从用途上来讲，培养基二属于_培养基，培养基，目的是为了获得目的是为了获得_；3.3.两种培养基共有的培养基成分有：两种培养基共有的培养基成分有：_；培养基一的碳源为培养基一的碳源为_，氮源为，氮源为_；培养基二的碳源为培养基二的碳源为_，氮源为，氮源为_；培养基一 培养基一牛肉膏 牛肉膏 5.0g 5.0g蛋白胨 蛋白胨 10.0g 10.0gNaCl NaCl 5.0g 5.0g琼脂 琼脂 20.0g 20.0g蒸馏水 蒸馏水 定

10、容 定容1000ml 1000ml培养基二 培养基二KH KH2 2PO PO4 41.4g 1.4gNaH NaH2 2PO PO4 42.1g 2.1gMgSO MgSO4 47H 7H2 2O O 0.2g 0.2g葡萄糖 葡萄糖 10.0g 10.0g尿素 尿素CO(NH CO(NH2 2)2 21.0g 1.0g琼脂 琼脂 15.0g 15.0g蒸馏水 蒸馏水 定容到 定容到1000ml 1000ml固体固体添加了凝固剂琼脂，且比例为添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%-2%1.5%-2%分离、鉴定、计数分离、鉴定、计数选择选择能分解尿素的微生物能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水

11、碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏、蛋白胨牛肉膏、蛋白胨牛肉膏、蛋白胨牛肉膏、蛋白胨葡萄糖葡萄糖尿素尿素新课讲解二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养1.1.从微生物群体中分离出目标微生物从微生物群体中分离出目标微生物(1)(1)微生物的分离：微生物的分离：将特定的微生物个体从同种微生物群体中或者从混杂的微将特定的微生物个体从同种微生物群体中或者从混杂的微生物群体中分离出来的技术，叫作微生物的分离生物群体中分离出来的技术，叫作微生物的分离。(2)(2)分离原理分离原理：选择培养的原理和稀释的原理。选择培养的原理和稀释的原理。(3)(3)分离方法分离方法：平板分离法平板分离法、选择培养分离选择培养分

12、离。平板分离法：平板分离法：包括包括稀释稀释涂布平板法涂布平板法和和稀释混合平板稀释混合平板法法。能将单个微生物分离。能将单个微生物分离和固定在和固定在固体固体 培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个形成单个菌落菌落。选择培养分离：选择培养分离：科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而特别适合这种微生物的生长，而抑制抑制其他微生物的生长。这种通过其他微生物的生长。这种通过选择培养选择培养进进行微生物纯培养分离的技术，称为行

13、微生物纯培养分离的技术，称为选择培养分离选择培养分离。新课讲解2.2.土壤微生物的分离土壤微生物的分离和和稀释涂布平板法稀释涂布平板法操作步骤操作步骤以以分离土壤中能分解分离土壤中能分解尿素尿素的的微生物微生物为例：为例：(1)(1)实验目的：分离以实验目的：分离以尿尿素为唯一素为唯一氮氮源的微生物。源的微生物。(2)(2)培养基配方特点：培养基配方特点：以以尿素尿素为唯一的为唯一的氮氮源源。(3)(3)基本步骤：基本步骤：制备培养基制备培养基取土样，并制备取土样，并制备土壤土壤悬悬液、液、进进行梯度稀行梯度稀释释稀释涂稀释涂布平板法接种布平板法接种适宜温度下培养适宜温度下培养观察。观察。新课

14、讲解2.2.土壤微生物的分离和土壤微生物的分离和稀释涂布平板法稀释涂布平板法操作步骤操作步骤(1)(1)铲取土样，将样品装入纸袋。铲取土样，将样品装入纸袋。(2)(2)将 将10 10g g土样加入盛有 土样加入盛有90mL 90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。取 无菌水的锥形瓶，充分摇匀。取1mL 1mL上清液加入盛 上清液加入盛有 有9mL 9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。无菌水的试管中，依次等比稀释。新课讲解(3)(3)从稀释倍数为 从稀释倍数为110 1107 7试管中取 试管中取0.1mL 0.1mL菌液，滴加到培养基表面。菌液，滴加到培养基表面。(4)(4)用涂布器将菌液均匀地涂

15、布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。取 取0.1mL 0.1mL菌液，滴加到 菌液，滴加到培养基表面。培养基表面。用涂布器将菌液均匀地 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂 涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使 布时可转动培养皿，使涂布均匀。涂布均匀。稀释涂布平板法的两个基本操作：稀释涂布平板法的两个基本操作：梯度稀释梯度稀释和和涂布平板。涂布平板。新课讲解 待待涂涂布布的的菌菌液液被被培培养养基基吸吸收收后后，将将平平板板倒倒置置，放放入入3030 3737的的恒恒温温培培养养箱箱中中培养培养1122d

16、d，在涂布有，在涂布有合适浓度合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落单菌落。注意：注意：1.10g1.10g土样加入盛有土样加入盛有90mL90mL无菌水中后，无菌水中后，已稀释已稀释1010倍倍，再计算时，不要忽略；，再计算时，不要忽略；2.2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；，所以还需要进一步验证；3.3.过程中所有操作都应在过程中所有操作都

17、应在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁进行；进行；4.4.将涂布器从酒精中取出时，要让多于的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上将涂布器从酒精中取出时，要让多于的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。稀释涂布平板法除稀释涂布平板法除可以分离微生物外，可以分离微生物外，也常用来统计样品中也常用来统计样品中活菌的数目；活菌的数目；新课讲解三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定(一一)间接计数法间接计数法稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释 稀释10 103 3倍 倍稀释 稀释10 104 4倍 倍

18、稀释 稀释10 105 5倍 倍空白对照 空白对照 2.2.原理原理 当样品的稀释度足够当样品的稀释度足够高高时，培养基表面时，培养基表面生长的一个生长的一个菌落菌落，来源于，来源于样品稀释液样品稀释液中中的一个的一个活菌活菌；通过计数平板上的；通过计数平板上的菌落菌落数，数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。就能推测出样品中大约含有多少活菌。*样品的样品的稀释度稀释度将直接影响平板上的菌将直接影响平板上的菌落数目；落数目；1.1.过程：过程：新课讲解3.3.计数原则计数原则*(1)(1)选择菌落数为选择菌落数为30-30030-300的平板计数；的平板计数；(2)(2)同一稀释度下，应至少对

19、同一稀释度下，应至少对33个平板进行重复计数，然后求出平均值。个平板进行重复计数，然后求出平均值。4.4.结果分析结果分析(1)(1)统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；原因：原因：_ _ _。(2)(2)统计结果一般用统计结果一般用_而不是用活菌数来表示；而不是用活菌数来表示；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落只是一个菌落菌落数菌落数(3)(3)计算：计算：C C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值平均值；V V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值代表涂布平板

20、时吸取的稀释液体积数值(mL)(mL)；M M代表稀释倍数；代表稀释倍数；则每则每gg(mL)(mL)样品中的细菌数样品中的细菌数=_=_。（CCVV）MM 有关问题：有关问题：1.1.样品稀释操作成功的标志是什么？样品稀释操作成功的标志是什么？提示：提示：得到 得到2 2个或 个或2 2个以上菌落数在 个以上菌落数在30-300 30-300的平板。的平板。2.2.为什么选择菌落数为 为什么选择菌落数为30-300 30-300的平板计数？的平板计数？提示：提示：小于 小于30 30，说明稀释倍数太大，菌液中细菌分布不均，各平板之间菌落数差异会很大而造成误差；，说明稀释倍数太大，菌液中细菌分布不均，各平板之间菌落数差异会很大而造成误差；大于 大于300 300，说明稀释倍数太小，会导致某些菌落的生长受到抑制，并且难以区分各个菌落而造成误差。，说明稀释倍数太小，会导致某些菌落的生长受到抑制，并且难以区分各个菌落而造成误差。为了保证计数菌落的准确性，因此选择菌落数为 为了保证计数菌落的准确性，因此选择菌落数为30-300 30-300的平板计数。的平板计数。