第五章基因工程载体优秀课件.ppt

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1、第五章基因工程载体第1页，本讲稿共73页载体类型基因工程所用的载体都经过人工重新构建 细菌质粒载体 噬菌体衍生载体 Cosmid 载体（粘粒）噬菌体M13 衍生载体 Phagemid 载体 酵母质粒载体 真核病毒载体2第2页，本讲稿共73页克隆载体与表达载体克隆载体：携带外源DNA 进入受体细胞并 使外源DNA 大量扩增。表达载体：表达外源基因编码的蛋白质，载体克隆位点的上游应含有启动子，下游含有转录终止序列。3第3页，本讲稿共73页第一 节.质粒 Plasmid质粒是存在于细菌细胞染色体外、能自主复制的小分子环状双链DNA 分子。又称为cccDNA（Covalently Closed Cir

2、cular DNA）。4第4页，本讲稿共73页野生型质粒的大小一般在2-200Kb 基因工程常用质粒在2-4Kb 之间 质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。5第5页，本讲稿共73页质粒(plasmid)6第6页，本讲稿共73页1.质粒类型:严紧型质粒(stringent plasmid)1-5 个拷贝/细胞 松弛型质粒(relaxed plasmid):数十个/细胞质粒在细胞中的拷贝数有时与寄主的种类有关。7第7页，本讲稿共73页2.质粒载体必须具备的条件（1）分 子 量 相 对 较 小，能 在 细 菌 内 稳 定 存在

3、，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。8第8页，本讲稿共73页（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。9第9页，本讲稿共73页质粒性质不相容性（不亲和性）具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒，不能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象称作质粒的不相容性。10第10页，本讲稿共73页3.质粒载体的选择性标记 抗菌素抗性 新陈代谢特性11第11页，本讲稿共73页 抗菌素名称 抗菌素作用方式 宿主菌抗性机理氨苄青霉素（A

4、mp）干扰细菌细胞壁合成 编码-内酰胺酶,切割Amp-内酰胺环氯霉素（Cml）抑菌剂,与50S 结合,干扰 编码乙酰转移酶,使氯霉素 蛋白质合成 乙酰化失活卡那霉素（Kan）杀菌剂,与70S 结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶,发生错读 修饰Kan 失活链霉素（Sm）杀菌剂,与30S 结合,mRNA 编码特异修饰酶 发生错读四环素（Tet）抑菌剂,与30S 结合，阻止 编码特异蛋白,修饰细菌膜 蛋白合成 结构,阻止Tet 通过细胞膜12第12页，本讲稿共73页复制起点氨苄青霉素抗性基因13第13页，本讲稿共73页常用的质粒载体1.pBR3222.220 载体是我国预防医学科学院病毒研究所自

5、行构建的大肠杆菌温控表达载体。3.pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。14第14页，本讲稿共73页15第15页，本讲稿共73页16第16页，本讲稿共73页17第17页，本讲稿共73页4.融合表达载体如GST 融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST 基因的下游。当基因表达时，表达产物为GST 与目的蛋白的融合体。18第18页，本讲稿共73页融合表达载体的优点 表达效率高 融合蛋白易纯化：抗GST 的蛋白质作为特异性抗体，用亲和层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白；可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质GST 与外源

6、蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点，可用适当的酶切割。19第19页，本讲稿共73页例如加装一段编码Ile-Glu-Gly-Arg 寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子a 切割，从Arg 后切开。目的蛋白中出现此种序列的可能性极小，因此该方法用途广泛。20第20页，本讲稿共73页QIAexpress 6 His 表达系统 重组蛋白质的末端带有6 个组氨酸残基，对带有Ni 离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。6 个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的结构和功能，无需切除。6 个组氨酸残基免疫原性差，重组蛋白可以直接用做抗原。21第21页，本讲稿共73页第二节 噬菌体类 噬菌体是一

7、类细菌病毒的总称，英文名为Bacteriophage,简称phage。噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。22第22页，本讲稿共73页噬菌体（bacteriophage,phage）噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。病毒的特性：个体微小，可以通过细菌滤器 没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成 专性细胞内寄生的微生物 可分为12 个科23第23页，本讲稿共73页噬菌体的生物学性状24第24页，本讲稿共73页噬菌体的生物学性状 形态 个体小，需用电子显微镜观察 蝌蚪形、微球形和丝形The black bars are size ba

8、rs representing 100 nm.25第25页，本讲稿共73页26第26页，本讲稿共73页27第27页，本讲稿共73页 用 作 克 隆 载 体 的 噬 菌 体 有 两 类：一 类 是噬菌体，另一类是M13 噬菌体。野 生 型 噬 菌 体 经 过 改 造，已 衍 生 出100多种 克 隆 载 体。噬 菌 体 载 体 分 为 插 入 型 和 替 换型(置换型)两类。目 前 应 用 较 广 的 是EMBL 系 列、gt 系 列 和Charon 系列等。28第28页，本讲稿共73页噬菌体（lambda phage)噬菌体是可以感染细菌的病毒，是大肠杆菌的温和型噬菌体。由外壳蛋白与一个48.

9、5kb 的双链线状DNA 分子组成。经过改造形成的噬菌体载体有较高的转化效率。29第29页，本讲稿共73页在 噬菌体DNA 分子双链的5 端，各有一段由12个核苷酸组成的互补的单链凸出序列，即通常所说的黏性末端。在寄主细胞内，会通过黏性末端的互补作用，形成环型双链DNA 分子。这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos 位点。（cos:cohensive end site)30第30页，本讲稿共73页 3 CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT 3 在黏性末端的12 个碱基中，有10 个是GC。通过碱基配对线性分子环化起来，由此形成的双链区，叫做cos 位点。31第31页，本讲稿共7

10、3页 噬菌体基因组含50 余个基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因对噬菌体的生长不是必须的，可以被外源DNA 片段取代。噬菌体上有56 种限制性内切酶的识别位点，约300 余切点。比如BamHI 分别在第5505、22346、27972、34499 和41732 处有识别位点。32第32页，本讲稿共73页噬菌体的生长途径 噬菌体有溶原和溶菌两种生长途径。溶原生长途径是指噬菌体的DNA 整合在宿主染色体上，随宿主染色体的复制而复制。以原噬菌体的形式潜伏起来。一旦宿主细胞处于某种条件下时，噬菌体的DNA 脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。33第33页，本讲稿共73页 溶菌生长是指噬菌体在宿主细胞

11、中黏性末端连接，成为环形DNA 分子，借用宿主细胞的体系，合成病毒包装所需的外壳蛋白，新复制的DNA 与外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。宿主细胞膜在R 蛋白和S 蛋白的作用下破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞。34第34页，本讲稿共73页 噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径(lysogenic pathway)35第35页，本讲稿共73页M13 噬菌体 单链DNA,基因组含6407 个碱基.经过基因改造后，形成M13mp 系列。可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7 倍).M13 噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但妨碍宿主细胞的生长,因此可见培养平

12、板上的混浊噬菌斑.36第36页，本讲稿共73页噬斑37第37页，本讲稿共73页 单链的M13 噬菌体（）进入受体菌后，以自身为模板，复制出互补链（），成为双链的结构，称为复制型DNA。复制型DNA 在细胞内可达200 个拷贝。此时，（）链被特异的蛋白质阻断，不再生成新的（）链。只能生成新的（）链。（）链DNA 被壳蛋白包装组成病毒颗粒，挤出宿主细胞。38第38页，本讲稿共73页科斯质粒载体（cosmid）又称粘粒载体，简称粘粒。环形双链DNA 分子，一般为4 6Kb。该载体含有DNA 的cos 序列（不少于280 个bp）和pBR322 质粒的序列。该载体转化效率高。可容纳高达45kb 的外源

13、DNA。以感染方式进入宿主细胞,在宿主体内象质粒那样复制.39第39页，本讲稿共73页 粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。又能像 DNA 一样体外包装，并高效导入受体细胞。属松弛型质粒，拷贝数较多。40第40页，本讲稿共73页41第41页，本讲稿共73页农杆菌Ti 质粒 根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌与植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤，故名Ti 质粒（tumor inducing plasmid）。Ti 质粒为双链环状DNA 分子，200 250Kb之间。Ti 质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为T-DNA（transfer

14、 DNA）。42第42页，本讲稿共73页 T-DNA 两端各有一个25bp 的正向重复序列，在不同的Ti 质粒中是高度保守的，该序列对于T-DNA 的转移和整合是不可缺少的。利用大肠杆菌质粒与T-DNA 的部分序列重组，构建Ti 质粒克隆载体，可用于植物细胞的基因转移。43第43页，本讲稿共73页第三节 酵母细胞基因工程载体 酵母是最简单的单细胞真核生物。酵母可对表达的多肽链进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、糖基化、除去N 端的甲硫氨酸等。44第44页，本讲稿共73页酵母菌的克隆载体YIP 酵母整合型质粒YRP 酵母复制型质粒YEP 酵母附加子型载体CIP 酵母菌着丝粒型质粒45第45页，本

15、讲稿共73页上述质粒均可在大肠杆菌和酵母菌中稳定存在，即所谓的穿梭质粒。这些质粒含有两种可供筛选的选择性标记。46第46页，本讲稿共73页YIp 载体URA3 乳清苷酸脱羧酶47第47页，本讲稿共73页 酵母菌表达载体1.选择性标志 当使用大肠杆菌做为宿主细胞时，多使用抗生素抗性作为筛选标志。由于酵母菌对许多抗生素不敏感，故需要其他的筛选标志。野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、TRP1（色氨酸）这些基因可补偿酵母菌细胞中某一种特定的代谢缺陷（营养缺陷）48第48页，本讲稿共73页2.启动子含有可被RNA 聚合酶II 识别的酵母启动子 GAL、GAL10（半乳糖激酶）PHO5（

16、碱性磷酸酶）ADH（醇脱氢酶）TP1（丙糖磷酸异构酶）PGK（磷酸甘油酸激酶）GAP（磷酸甘油醛脱氢酶）SUC（蔗糖酶）49第49页，本讲稿共73页注释：细胞内某些蛋白质丰度较高，如PGK（磷酸甘油酸激酶）、GAP（磷酸甘油醛脱氢酶），各占细胞总蛋白的5%，属于高含量的蛋白质，它们的启动子为强启动子。50第50页，本讲稿共73页酵母分泌型表达载体 这类载体可以使目的蛋白分泌到细胞外。载体内除含有一般表达质粒的必要成分外，还需有一个控制蛋白质分泌的信号序列。其编码的多肽链叫做信号肽。信号肽内多含疏水性氨基酸。51第51页，本讲稿共73页第四节 哺乳动物细胞表达载体52第52页，本讲稿共73页 病

17、毒侵入动物细胞后，有两种生长状态 溶细胞感染 病毒在宿主细胞内合成自身的核酸和结构蛋白，装配成完整的子代病毒颗粒，释放到细胞外，扩大感染，宿主细胞因为代谢障碍而死亡。整合性感染 病毒核酸整合到宿主细胞的染色体中，随细胞DNA的复制而扩增。53第53页，本讲稿共73页病毒载体：（1）含有能够被真核细胞识别的有效启动子（2）在感染周期中能够持续复制，达到很高的拷贝数。（3）控制自己复制的元件（4）有些载体可高效稳定地整合到寄主基 因组上（5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基 因高效导入受体细胞。54第54页，本讲稿共73页1.SV40 病毒载体SV40：猿猴空泡病毒（Simian vacuolat

18、ing virus 40)环型双链DNA 分子，含5243bp。优点：1.感染率高；2.拷贝数高；3.转录产物 高；缺点：1.宿主范围窄；2.最终导致感染细胞死 亡；3.制备耗时，成本较高。55第55页，本讲稿共73页SV40 病毒载体的改建病毒的部分序列质粒的部分序列 如PSV2 包括 病毒的复制起始区、早期启动子、增强子序列、部分t 抗原基因 pBR322 的复制起始区、氨苄青霉素 抗性基因56第56页，本讲稿共73页病毒-质粒载体 病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的质粒分子重组而成。例如：p C10 早期区段和复制起点（多瘤病毒）质粒pBR322 的部分区段 这种载体既可在大肠杆菌中复

19、制，也可在哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。57第57页，本讲稿共73页改造后的病毒优缺点 优点：1.不需病毒颗粒的包装过程，故可插入较大长 度的DNA 片段。2.不引起宿主细胞的裂解，可建立稳定传代的 细胞株。3.整合到宿主细胞的染色体中，重组基因不会丢失。缺点：转染效率低于万分之一。58第58页，本讲稿共73页受纳细胞：SV40 感染CV-1 或AGMK 猿猴细胞后，产生感染性病毒颗粒，并使宿主细胞裂解，这种感染称为裂解感染，而猿猴细胞则称为受纳细胞。59第59页，本讲稿共73页非受纳细胞：SV40 感染仓鼠细胞后，不产生感染颗粒，病毒基因组整合到宿主细胞染色体上，细胞被转化（癌变），这

20、种啮齿类动物细胞为SV40 病毒的非受纳细胞。60第60页，本讲稿共73页逆转录病毒载体 逆转录病毒是一类单链RNA 病毒。宿主范围广，感染动物或人的细胞。感染效率高，理论上可达100。具有强启动子。不引起宿主细胞的死亡，可以维持许多代存在问题：1.容量小，低于10kb。2.可能引起细胞癌变。61第61页，本讲稿共73页腺病毒载体（AV）线性双链DNA 病毒，经过改造的腺病毒载体，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。62第62页，本讲稿共73页 优点：基因组大，可插入大片段的外源基因，最多可 达 35kb；可高效的感染不同类型的人体组织细胞；进入细胞内不整合进宿主的基因组，仅瞬间表达。缺点 免疫

21、原性强，可刺激机体产生免疫反应；几乎可感染所有的细胞，缺乏特异性。63第63页，本讲稿共73页腺相关病毒载体（AAV）：属于非致病的微小 病毒科家族的成员，只有依赖于辅助病毒才能繁殖。特点：基因组小，只有几个kb；无致病性；免疫原性弱；装载外源基因容量小，不超过5kb；制备过程复杂；64第64页，本讲稿共73页痘苗病毒载体：痘苗病毒是动物病毒中最大的一种，与天花病毒有密切的亲缘关系。长期被用作预防天花的疫苗。病毒基因组中有很大的非必需区（28kb），可以切除，代之以较大的外源基因，或者同时插入几个外源基因，构成多价疫苗。65第65页，本讲稿共73页哺乳动物细胞基因转移的选择标记 氨基糖苷磷酸转移酶：G418 二氢叶酸还原酶（DHFR）MTX（氨甲喋呤）胸苷激酶（TK）：APT（氨基喋呤）潮霉素-B-磷酸转移酶（HPH）：潮霉素-B 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）：霉酚酸 腺嘌呤核糖脱氨酶（ADA）：66第66页，本讲稿共73页