血清酶类测定精选课件.ppt

《血清酶类测定精选课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血清酶类测定精选课件.ppt（132页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于血清酶类测定第一页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识酶（酶（enzymeenzyme）的本质：）的本质：高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性 酶的应用：酶的应用：由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂 酶的特点：酶的特点：酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断床诊断和疗效判断第二页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识一、酶活性一

2、、酶活性定义：酶活性（定义：酶活性（enzyme activityenzyme activity）也称为酶活力，指酶）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量产物的生成量或或底物的减少量底物的减少量。表示方法：表示方法：或或 式中式中v v：反应速率，：反应速率，P P：产物浓度，：产物浓度，t t：时间，：时间，SS：底物浓度。：底物浓度。第三页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识二、酶活性单位与酶活性浓度二、酶活性单位与酶活性浓度（一）酶活性单位（一）酶活性单位定义：表示酶的相对含量，定义：表示酶的相对含

3、量，指在一定条件下，单位时间内指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。表示方法：表示方法：惯用单位（一定的反应量惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）一定的反应时间）国际单位国际单位IUIU（mol/minmol/min）KatalKatal单位（单位（mol/smol/s）第四页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识1 1惯用单位：惯用单位：2020世纪世纪6060年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位 ALPALP的金氏单位（的金

4、氏单位（KingKing）氨基移转酶的卡门氏单位（氨基移转酶的卡门氏单位（KarmenKarmen）特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较现在临床应用较少。少。卡门氏单位：卡门氏单位：1.0ml1.0ml血清在血清在2525，340nm340nm，反应体积，反应体积3.0ml,3.0ml,光径光径1.0cm1.0cm时每分时每分钟测定吸光度下降钟测定吸光度下降0.0010.001，即消耗，即消耗4.82 4.82 10 10-4mol N

5、ADH-4mol NADH为一个卡门氏单位为一个卡门氏单位举例：举例：金氏单位：金氏单位：100ml100ml血清血清ALPALP在在3737与底物作用与底物作用15min15min，产生，产生1mg1mg酚。酚。第五页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识2.2.国际单位国际单位IUIU（mol/minmol/min）定义：在规定条件下（定义：在规定条件下（2525及其他最适条件），每及其他最适条件），每minmin催化催化1 1molmol底物转变为产物的酶量，为底物转变为产物的酶量，为1IU1IU或或1U1U，1IU=11IU=1mol/minmol/min。IFC

6、C,2001IFCC,2001年年37373 3KatalKatal单位单位 定义：定义：1Katal1Katal是在规定条件下，每秒钟催化是在规定条件下，每秒钟催化1mol1mol底物转变为产物的底物转变为产物的酶量。酶量。1Katal1Katal1mol/s1mol/s。IUIU与与KatalKatal单位的关系：单位的关系：1katal=60101katal=60106 6IUIU，1IU=16.67nkatal 1IU=16.67nkatal 第六页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识（二）酶活性浓度（二）酶活性浓度 酶活性浓度指酶活性浓度指单位体积样本中的酶活

7、性单位单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用国际单位用IU/LIU/L或或U/LU/L表示表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.第七页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识三、酶促反应进程三、酶促反应进程 以以产物生成量（或反产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标反应时间为横坐标作图所作图所得到的一条曲线，称为反得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲曲线、速率

8、曲线、时间曲线）线）t1 t2 时间t 图5-1酶促反应进程曲线吸光度A延滞期线性期非线性期第八页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识（一）延滞期（一）延滞期（lag phase、延迟期、延迟期）特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟 t1 t2 时间t 图5-1酶促反应进程曲线吸光度A线性期非线性期R1R2延滞期孵育期延滞期第九页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识（二）线性期（二）线性期此阶段酶促反应速率此阶段酶促反应速率基本保持恒定基本保持恒定；对底物

9、而言，为反应速率与底物浓度对底物而言，为反应速率与底物浓度SS的零次方成正比的的零次方成正比的零级反应零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比；此时底物的消耗量小于此时底物的消耗量小于5%5%，反应速率，反应速率为反应初速率为反应初速率。酶活性浓度越高，线性期就越短酶活性浓度越高，线性期就越短 线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A A）相对于时间（）相对于时间（minmin）变化的可以接受的程）变化的可以接受的程度度。线性度线性度=前半段前半段A/minA/min后半段后半段A/minA/m

10、in/（前半段（前半段A/minA/min后半段后半段A/minA/min）/2/2100100 线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于1515，否则判为非线性，否则判为非线性特点：可代表酶促反应速度特点：可代表酶促反应速度第十页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识（三）非线性期（三）非线性期（偏离线性期、平坦期偏离线性期、平坦期）进入非线性期的原因：进入非线性期的原因：反应的不断进行，反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加产物抑制增加

11、等使得反应速率明显下降。等使得反应速率明显下降。特点：特点：若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度SS的一次方的一次方成正比，为成正比，为一级反应一级反应。第十一页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识（一）酶促反应（一）酶促反应酶促反应式酶促反应式米氏方程：米氏方程：K4第十二页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识（二）（二）Km的含义与意义的含义与意义1 1K Km m的含义的含义:当当K Km m=S=S时，时，可见，可见K Km m值等于反应速率达到最大反应速率值等于反应速率达到最大反应速率

12、V Vmaxmax一半时的底物浓度。一半时的底物浓度。2 2KmKm的意义的意义 KmKm是酶的一个是酶的一个特征性常数特征性常数（其他如等电点），（其他如等电点），KmKm的大小只与酶的性质有关的大小只与酶的性质有关反映反映酶对底物亲和力酶对底物亲和力的大小的大小 选择酶的选择酶的最适底物最适底物或天然底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类鉴别酶的种类 判断可逆反应的速率判断可逆反应的速率 判断酶偶联反应的限速反应判断酶偶联反应的限速反应计算工具酶的用量计算工具酶的用量第十三页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识（三）（

13、三）Vmax的含义的含义定义：定义：VmaxVmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。应用：计算酶的转换数（应用：计算酶的转换数（TN，催化常数，催化常数Kcat）单位时间内每个酶分）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值子将底物分子转换成产物的最大值 。计算公式为：计算公式为：(单位是单位是s s-1-1)计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）第十四页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复

14、习酶学分析基础知识第三节第三节 酶活性的测定酶活性的测定测定方法分类：测定方法分类：按照仪器检测方法分类按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、：分光光度法、浊度法、荧光法、放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。按照反应时间分类按照反应时间分类；分为；分为定时法、连续监测法定时法、连续监测法和平衡法。和平衡法。按照检测对象分类按照检测对象分类：分为直接法和间接法。：分为直接法和间接法。第十五页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识一、按照反应时间分类的酶活性测定方法一、按照反应时间分类的酶活性测定方法（一）定时法（一

15、）定时法原理原理：定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1t1t2t2）产）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反应进行到一定该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。特点特点：优点优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。

16、缺点缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2t1-t2）是否为零级反应）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。故难以确保测定结果的准确性。吸光度At1 t2 时间t图5-6定时法的三种反应进程231定时法与两点法、终点法的区别定时法与两点法、终点法的区别第十六页，本课件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识（二）连续监测法（二）连续监测法原理原理：连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性期内的生连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法，

17、又称速率法、零级成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法，又称速率法、零级反应速率法、斜率法。反应速率法、斜率法。该方法是在一定的反应时间区段内（至少该方法是在一定的反应时间区段内（至少9 9120s120s）每隔一定时间（常为）每隔一定时间（常为2 230s30s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少4 4点），点），然后对吸光度数然后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位时间内的反应速据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位时间内的反应速率率A/minA/min，最后据式计算出酶活性。最后据式计算出酶活性。第十七页，本课

18、件共有132页复习酶学分析基础知识复习酶学分析基础知识第十八页，本课件共有132页第十九页，本课件共有132页 血浆特异酶血浆特异酶 在血浆中发挥特定的催化作用的酶称为血浆特异性酶，亦称血浆功能性酶在血浆中发挥特定的催化作用的酶称为血浆特异性酶，亦称血浆功能性酶。多数由。多数由肝脏肝脏合成并以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活起作用。合成并以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶原：与凝血有关的酶或酶原：ChEChE、铜蓝蛋白及脂蛋白脂肪酶等。、铜蓝蛋白及脂蛋白脂肪酶等。外分泌酶外分泌酶 由由外分泌腺外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶称外分泌酶合成并分泌进入血浆的酶称外分

19、泌酶,参与食物的消化过程，参与食物的消化过程，正常血液中含量很少。正常血液中含量很少。包括包括P-AMYP-AMY、胰脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。、胰脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。细胞酶细胞酶 存在于存在于细胞内细胞内进行物质代谢的酶。随着细胞的不断更新或破坏可少进行物质代谢的酶。随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。量释入血液。当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。一、一、一、一、血清酶的来源血清酶的来源血清酶的来源血清酶的来源 第二十页，本课件共有132页二、酶活性测定在临床诊断中的应用二

20、、酶活性测定在临床诊断中的应用 由于酶广泛分布于全身各器官、组织，所以酶活性的由于酶广泛分布于全身各器官、组织，所以酶活性的测定用于消化系统、心血管、骨骼、肌肉、肾等器官测定用于消化系统、心血管、骨骼、肌肉、肾等器官和组织的疾病与恶性肿瘤的诊断。和组织的疾病与恶性肿瘤的诊断。第二十一页，本课件共有132页（一）在诊断肝胆疾病中的应用（一）在诊断肝胆疾病中的应用 肝是机体新陈代谢最活跃的器官，这是由于肝细胞中含有最丰富的酶类。肝酶谱：肝酶谱：AST、ALT、GGT、ALP、TP、ALB、GLB、TBILI、DBILI、IBILI、CHE主要是用来判断有无肝实质细胞损伤、肝内外胆汁淤积等肝胆疾病。

21、ALT被认为是肝细胞损伤最敏感的指标之一。CHE在急性肝炎、肝硬化、农药中毒时，可降至正常30%50%。GGT、ALP等酶主要用于胆道疾病特别是胆道梗阻时的临床诊断。单胺氧化酶（MAO）是结缔组织中的酶类，其活性测定可用于肝纤维化程度的判断。第二十二页，本课件共有132页（二）在诊断心肌梗死中的应用（二）在诊断心肌梗死中的应用用于诊断心肌梗死的血清酶主要有AST、LDH、CK、CK-MB和-HBD。AST广泛分布于机体各组织中，但在心肌中含量最多。LDH是低度特异性酶，LDH1在心肌中含量最高，LDH2酶活性LDH1 当心肌梗死时，LDH1LDH2CK-MB在诊断心肌梗死最佳的血清酶指标。当心

22、肌梗死时，CK-MB可增高1025倍。m-AST（线粒体型天门冬氨酸氨基转移酶）与心肌梗死并发 心力衰竭的发病率和死亡率有正比关系。第二十三页，本课件共有132页（三）在诊断胰腺疾病中的应用（三）在诊断胰腺疾病中的应用用于急性胰腺炎的诊断和鉴别诊断的酶有AMY及其同工酶、LPS(脂肪酶)等。均来自胰腺泡的分泌。AMY 在急性胰腺炎时，显著升高。注意：注意：伴有高血脂的急性胰腺炎和静止性胰腺炎时，AMY 活性正常。LPS 在诊断胰腺炎特异性较高，但尿液中检测不到LPS。第二十四页，本课件共有132页（四）在诊断骨骼疾病中的应用（四）在诊断骨骼疾病中的应用ALP是各种骨骼疾病最重要的酶学诊断指标当

23、发生骨骼肌疾病时，特别是成骨肉瘤、畸形骨炎，可分别增至正常的45倍与30倍。第二十五页，本课件共有132页（五）在诊断前列腺疾病中的应用（五）在诊断前列腺疾病中的应用ACP(碱性磷酸酶)用于诊断前列腺疾病，特别是诊断前列腺癌的最重要指标。主要分布于前列腺、红细胞、血小板等，成年男子血清中1/31/2的ACP来自于前列腺。第二十六页，本课件共有132页（六）在诊断肿瘤中的应用（六）在诊断肿瘤中的应用具有器官特异性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；非器官特异性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。在肿瘤发生、发展及组织癌变过

24、程中在肿瘤发生、发展及组织癌变过程中，与细胞正常分化、增殖功能有关的酶或同工酶活性下降，并出现肿瘤组织中的同工酶升高。第二十七页，本课件共有132页血清酶的生理变异血清酶的生理变异血清酶的生理变异血清酶的生理变异血清酶的生理变异血清酶的生理变异 1.1.性性别别 少少数数酶酶如如CKCK、ALPALP及及GGTGGT等等有有性性别别差差异异，与与血血清清酶酶的的来来源源组组织织有有关。关。2.2.年年龄龄 血血清清酶酶的的活活性性随随年年龄龄而而变变化化，ALPALP和和GGTGGT到到老老年年时时可可有有轻轻度度升升高高。年龄差异也见于同工酶。年龄差异也见于同工酶。3.3.进食进食 过量饮酒

25、可使血清过量饮酒可使血清GGTGGT明显升高。明显升高。4.4.运运动动 多多种种血血清清酶酶活活性性升升高高，如如CKCK、LDLD、ASTAST、ALDALD和和ALTALT等等，其其升升高高的的幅度与运动量、持续时间、运动频率及骨骼肌所含的酶量有关。幅度与运动量、持续时间、运动频率及骨骼肌所含的酶量有关。5.5.妊妊娠娠 胎胎盘盘组组织织可可分分泌泌一一些些酶酶进进入入母母体体血血液液，如如耐耐热热ALPALP、LDHLDH、LAPLAP和和ALTALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升高。（少数）等，引起血清中这些酶活性升高。6.6.其其他他 一一些些酶酶活活性性与与体体重重、身身高高

26、的的增增长长、体体位位改改变变、昼昼夜夜变变化化及及家家庭庭因素有关。因素有关。第二十八页，本课件共有132页酶的区域化分布酶的区域化分布酶的区域化分布酶的区域化分布 血清酶符号来源丙氨酸氨基转移酶门冬氨酸氨基转移酶肌酸激酶乳酸脱氢酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶-谷氨酰转移酶5-核苷酸酶单胺氧化酶-淀粉酶脂肪酶谷氨酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶胆碱酯酶山梨醇脱氢酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶ALTASTCKLDHALPACP-GT或GGT5-NTMAOAMS或AMYLPSGLDHICDCHESDHOCTLCAT肝、肾、心心、肝、骨骼肌骨骼肌、心、脑心、肾、骨骼肌、肝、肺小肠、胎盘、肝、肾前列腺、

27、红细胞、血小板肝、胆、肾、小肠肝、胆道肝、肾、脑胰、唾液腺胰肝肝、胎盘、心肝肝肝肝第二十九页，本课件共有132页第三十页，本课件共有132页标本（血清或血浆）临床酶学测定酶之前，标本还要经过采集、分离临床酶学测定酶之前，标本还要经过采集、分离和储存等一系列处理过程。而酶在血中处于一个动和储存等一系列处理过程。而酶在血中处于一个动态变化过程，血液离开机体后还会有一定变化。因态变化过程，血液离开机体后还会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值的变化。定值的变化。第三十一页，本课件共有132页 标本应避免溶血：标本应避免溶血：大多数

28、酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多，少量血细，少量血细胞的破坏就可能引起血浆中酶明胞的破坏就可能引起血浆中酶明显升高。如红细胞内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高150、15和7倍左右，故测定这些酶时，样品应避免溶血。及时分离血清（血浆）：及时分离血清（血浆）：静脉采血后，必须在1-2h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免血细胞中的酶通过细胞膜进入血清而引起误差。第三十二页，本课件共有132页 尽量用血清标本：尽量用血清标本：大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，临床上除非测定与临床上除非测定与凝血或纤

29、溶有关的酶，凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清作为首选测定标本一般都应以血清作为首选测定标本。及时测定，如不能及时测定，应放入冰箱保存（但有些标及时测定，如不能及时测定，应放入冰箱保存（但有些标本不能冷冻）本不能冷冻）为防止酶蛋白变性，一般至少应在血清分离后的当天进行测定，否则应放冰箱冷藏 有些酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在低温(特别是20冰冻)可引起不可逆性失活，反而不如室温稳定（“冷变性”）。第三十三页，本课件共有132页第二节、氨基转移酶活性测定第二节、氨基转移酶活性测定氨基转移酶又称转氨酶，在机体内多达60余种，广泛存在于肝脏、心肌、骨骼肌、肾、脑、胰、肺、白细胞、红细胞中。其

30、中以丙氨酸氨基转移酶(ALT或GPT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST或GOT)两种最为重要，它们催化机体内氨基酸的转氨基反应：ALTL-丙氨酸丙氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸+L-谷氨酸谷氨酸 ASTL-天门冬氨酸天门冬氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸+L-谷氨酸谷氨酸 A-NH2+B A+B-NH2转氨酶转氨酶第三十四页，本课件共有132页1.赖氏赖氏比色法比色法选择在选择在500-520nm500-520nm处检测，丙酮酸苯腙的显色强度约为处检测，丙酮酸苯腙的显色强度约为-酮戊二酸苯腙的酮戊二酸苯腙的3 3倍倍 必须降低必须降低必须降低必须降低底物底物-酮戊二酸酮戊二酸及

31、及2,4-2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼的浓度的浓度ALTALT测定不是测定不是在最佳条件下进行，反应中丙酮酸生成量与在最佳条件下进行，反应中丙酮酸生成量与ALTALT活性不能呈现良好的线性关系活性不能呈现良好的线性关系(这是赖氏法的最大缺陷这是赖氏法的最大缺陷)，其标准曲线不呈直线而，其标准曲线不呈直线而为抛物线。为抛物线。2,4-2,4-二硝二硝基苯肼基苯肼丙酮酸苯腙丙酮酸苯腙(在碱性条件下呈红棕色在碱性条件下呈红棕色)-酮戊二酸苯腙酮戊二酸苯腙(在碱性条件下呈红棕色在碱性条件下呈红棕色)丙氨酸丙氨酸 +-+-酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸 +谷氨酸谷氨酸 ALT37pH7.4丙氨酸氨基转移

32、酶（丙氨酸氨基转移酶（ALTALT）活性测定）活性测定第三十五页，本课件共有132页试剂与器材1、0.1mol/L磷酸氢二钠溶液2、0.1mol/L磷酸二氢钾溶液3、0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.4）4、底物缓冲液5、1.0mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液6、0.4mol/L氢氧化钠溶液7、2mmol/L丙酮酸标准液8、器材 试管、恒温水浴箱、刻度吸管、微量移液器、分光光度计、坐标纸。第三十六页，本课件共有132页实践步骤实践步骤 加入物（ml）测定管 对照管血清 0.1 0.1 底物缓冲液 0.5 -混匀，在37恒温水浴箱中保温30min2，4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5底物缓

33、冲液 -0.5 混匀后，置37水浴保温20min，每管加入0.4mol/LNaOH5.0ml，混匀，室温放置5min，用分光光度计在波长505nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度。第三十七页，本课件共有132页参考范围：参考范围：5-255-25卡门单位卡门单位注意事项注意事项1.血清ALT在室温（25 ）可以保存2d，在4 冰箱可保存2 周，在-20 可保存1个月。2.严重脂血、黄疸、溶血血清可增加测定的吸光度。3.糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能与2，4-二硝 基苯肼溶液作用呈色，引起吸光度增加，因此，此类标本应 做对照管。第三十八页，本课件共有132页方法评价方法评价 1.操作

34、简便，操作简便，不需要紫外分光光度计，易于普及不需要紫外分光光度计，易于普及，所用的酶活性，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，使其结果与速率法较为一，使其结果与速率法较为一，使其结果与速率法较为一，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。致，能较好反映酶的真实活性。致，能较好反映酶的真实活性。致，能较好反映酶的真实活性。故卫生部临检中心建议国内无条故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。件使用连续监测法的单位使用赖氏法。2.2.不适用自动分析仪不适用自动分析仪不适用自动分析仪不适用自动分析仪；试剂稳定性差，底物缓冲液不

35、易保存；试剂稳定性差，底物缓冲液不易保存；试剂稳定性差，底物缓冲液不易保存；试剂稳定性差，底物缓冲液不易保存(易长菌易长菌易长菌易长菌)；由于赖氏法必须降低；由于赖氏法必须降低；由于赖氏法必须降低；由于赖氏法必须降低底物底物-酮戊二酸酮戊二酸及及2，4-二硝二硝基苯肼基苯肼的浓度，造成的浓度，造成ALT测定不是在最佳条件下进行，测定不是在最佳条件下进行，反应中丙反应中丙酮酸生成量与酮酸生成量与ALT活性不能呈现良好的线性关系，这是赖氏法活性不能呈现良好的线性关系，这是赖氏法的最大缺陷的最大缺陷。第三十九页，本课件共有132页(二二)速率法速率法转氨酶的测定多用比色法，以赖氏法最常用。目前，转氨

36、酶的测定多用比色法，以赖氏法最常用。目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。国内外实验室多采用连续监测法进行测定。ALTALT速率法测定中酶偶联反应式为：速率法测定中酶偶联反应式为：ALT L-L-丙氨酸丙氨酸+-+-酮戊二酸酮戊二酸 L-L-谷氨酸谷氨酸 +L-+L-丙酮酸丙酮酸 LDLD 丙酮酸丙酮酸 +NADH+H+NADH+H+L-L-乳酸乳酸 +NAD+NAD+上述偶联反应中，上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在340nm检测吸光度下降检测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-

37、Amin)，计算出，计算出ALT的活性浓度。的活性浓度。第四十页，本课件共有132页 参考区间参考区间 速率法：速率法：男性：男性：5 540 U/L40 U/L 女性：女性：5 535 U/L35 U/L 第四十一页，本课件共有132页 ALT ALT广泛分布于全身各组织器官，尤以广泛分布于全身各组织器官，尤以肝细胞肝细胞中含量最多，其中含量最多，其次是肾脏、心脏及骨骼肌，通常只有极少量释放入血液，所以血次是肾脏、心脏及骨骼肌，通常只有极少量释放入血液，所以血清中此酶的活力很低，当这些组织病变时，细胞坏死或通透性增清中此酶的活力很低，当这些组织病变时，细胞坏死或通透性增加，细胞内酶大量释放入

38、血，使血清中该酶活力显著增高。加，细胞内酶大量释放入血，使血清中该酶活力显著增高。临床意义临床意义(1)(1)肝胆疾病肝胆疾病：急性病毒性肝炎、慢性活动型肝炎、脂肪肝、肝癌、肝硬变活急性病毒性肝炎、慢性活动型肝炎、脂肪肝、肝癌、肝硬变活动期、中毒性肝炎、胆结石、胆管炎和胆囊炎等。动期、中毒性肝炎、胆结石、胆管炎和胆囊炎等。(2)(2)心血管疾病心血管疾病：急性心肌梗死、急性心肌炎、急性心力衰竭、脑出血等。急性心肌梗死、急性心肌炎、急性心力衰竭、脑出血等。(3)(3)骨骼肌疾病骨骼肌疾病：多发性肌炎、进行性肌营养不良等。多发性肌炎、进行性肌营养不良等。（4 4）一些药物和毒物可引起一些药物和毒物

39、可引起ALTALT活性升高活性升高：如氯丙嗪、异菸肼、苯巴比如氯丙嗪、异菸肼、苯巴比妥、奎宁、水杨酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等妥、奎宁、水杨酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等 第四十二页，本课件共有132页ALTALT在肝脏疾病中的应用价值在肝脏疾病中的应用价值ALTALT急性明显升高，常达急性明显升高，常达200U200U以上，病情较重者可达以上，病情较重者可达400-600U400-600U以上，甚至更高，以上，甚至更高，个别重型病人甚至可超过个别重型病人甚至可超过1000U1000U。ALTALT越高，肝脏细胞损害越严重。越高，肝脏细胞损害越严重。慢性活动性肝炎：慢性活

40、动性肝炎：ALTALT持续轻度升高几十或持续轻度升高几十或100U100U以上（以上（100100200U200U）慢性肝炎慢性肝炎 急性肝炎急性肝炎重型肝炎重型肝炎 由于肝细胞发生大量变性，坏死，使由于肝细胞发生大量变性，坏死，使ALTALT大量进入血液，因此，大量进入血液，因此，ALTALT迅速迅速升高，高达数百升高，高达数百1000U1000U以上，如果以上，如果ALTALT含量越高，上升越快，说明肝细胞坏含量越高，上升越快，说明肝细胞坏死严重，病情进展也越快。死严重，病情进展也越快。当病情发展到一定的严重程度，肝细胞大量坏死，肝脏生产当病情发展到一定的严重程度，肝细胞大量坏死，肝脏生产

41、ALTALT的能力丧的能力丧失，这时血液中的失，这时血液中的ALTALT降低，但是黄疸却持续升高（胆红素上升），这种现象即降低，但是黄疸却持续升高（胆红素上升），这种现象即所谓所谓“酶胆分离酶胆分离”，往往提示病情正在恶化，常是肝坏死征兆。，往往提示病情正在恶化，常是肝坏死征兆。第四十三页，本课件共有132页ALTALT增高程度与肝硬化的活动度和肝组织炎症改变及肝细胞损害程度相一致。增高程度与肝硬化的活动度和肝组织炎症改变及肝细胞损害程度相一致。对对ALTALT进行监测有助于对肝硬化病情的判断。若是静止性肝硬化，则进行监测有助于对肝硬化病情的判断。若是静止性肝硬化，则ALTALT维持正常维持正

42、常 ；肝硬化病人的转氨酶出现较大幅度的升高，提示病情；肝硬化病人的转氨酶出现较大幅度的升高，提示病情可能发展成活动性，须引起警惕。可能发展成活动性，须引起警惕。肝硬化肝硬化肝癌肝癌 80%80%90%90%肝细胞都是在肝硬化基础上发生的，因此，在早期，肝细胞都是在肝硬化基础上发生的，因此，在早期，ALTALT是否增高是否增高主要决定于肝硬化的活动程度。若是静止性肝硬化，则主要决定于肝硬化的活动程度。若是静止性肝硬化，则ALTALT维持正常，因为肝维持正常，因为肝细胞发生癌变时，细胞并没有坏死破坏，细胞发生癌变时，细胞并没有坏死破坏，ALTALT没有释放出来，因此，没有释放出来，因此，ALTAL

43、T没有升高，或没有升高，或ALTALT有轻度或中度增高。有轻度或中度增高。第四十四页，本课件共有132页血清天冬氨酸氨基转移酶（血清天冬氨酸氨基转移酶（ASTAST）活性测定）活性测定 测定方法测定方法 一、速率法（连续监测法一、速率法（连续监测法 ）NADH NADH在在340nm340nm处有特征吸收峰，连续监测处有特征吸收峰，连续监测NADHNADH消耗引起的消耗引起的340nm340nm吸光度变化吸光度变化,根据根据340nm340nm处吸光度下降速率（处吸光度下降速率（A/minA/min）计算计算ASTAST活性活性 参考方法参考方法第四十五页，本课件共有132页 ASTASTL-

44、L-天门冬氨酸天门冬氨酸 +-+-酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸 +L-+L-谷氨酸谷氨酸 自发自发脱羧脱羧 丙酮酸丙酮酸（二）赖氏比色法（二）赖氏比色法第四十六页，本课件共有132页 参考区间参考区间 赖氏比色法：赖氏比色法：8 82828卡门单位（反应温度为卡门单位（反应温度为3737）速率法：速率法：8 840 U/L40 U/L（反应温度为（反应温度为3737，试剂不含，试剂不含P5PP5P）第四十七页，本课件共有132页 临床意义临床意义 1.AST1.AST广泛分布于全身各组织器官，广泛分布于全身各组织器官，在心肌细胞内含量最多在心肌细胞内含量最多，当心肌梗死时，血清中当心肌梗

45、死时，血清中ASTAST活力增高，在发病后活力增高，在发病后6 612h12h之内显著之内显著增高，在增高，在48h48h达到高峰，约在达到高峰，约在3 35d5d恢复正常。恢复正常。2.2.血清中的血清中的ASTAST也可来源于肝细胞，各种肝病可引起血清也可来源于肝细胞，各种肝病可引起血清ASTAST的升高，有时可达的升高，有时可达12001200卡门单位，中毒性肝炎还可更高。卡门单位，中毒性肝炎还可更高。3.3.肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎等也可引起血清肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎等也可引起血清ASTAST的轻度增高。的轻度增高。第四十八页，本课件共有132页AST/ALTAST/ALT比值大小有

46、助于临床判断肝病严重程度比值大小有助于临床判断肝病严重程度急性肝炎的急性肝炎的AST/ALTAST/ALT均值为均值为0.56:10.56:1肝硬化的肝硬化的AST/ALTAST/ALT均值为均值为1.131.13：1 1肝癌组肝癌组AST/ALTAST/ALT均值为均值为2.412.41：1 1急性肝坏死组急性肝坏死组AST/ALTAST/ALT均值为均值为3.613.61：1 1 肝细胞中的总含量：肝细胞中的总含量：ASTAST（主要存在于肝细胞线粒体内）（主要存在于肝细胞线粒体内）ALTALT（主要存在于肝细胞胞浆内）（主要存在于肝细胞胞浆内）肝细胞轻度损伤时主要是胞浆酶释放出来，血清中

47、肝细胞轻度损伤时主要是胞浆酶释放出来，血清中ALTALTASTAST；而肝细胞重度损伤；而肝细胞重度损伤时胞浆酶、线粒体酶均释放出来，血清中时胞浆酶、线粒体酶均释放出来，血清中ASTASTALTALT；随着肝病由轻变重，；随着肝病由轻变重，AST/ALTAST/ALT的比值就由的比值就由1 1变为变为1 1第四十九页，本课件共有132页第三节第三节 血清血清r-r-谷氨酰基转移酶测定谷氨酰基转移酶测定第五十页，本课件共有132页血清血清-谷氨酰转移酶（谷氨酰转移酶（GGTGGT）活性测定）活性测定 GGTGGT是催化是催化-谷氨酰基移换反应的一种酶谷氨酰基移换反应的一种酶GGTGGT分布于肾、

48、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织中，其分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织中，其中以肾脏含量最多。中以肾脏含量最多。GGTGGT在肝脏中广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整个胆管系在肝脏中广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整个胆管系统，因此当肝内合成亢进或胆汁排出受阻时，血清中统，因此当肝内合成亢进或胆汁排出受阻时，血清中GGTGGT增高。增高。第五十一页，本课件共有132页 以以-谷氨酰谷氨酰-萘胺萘胺作为作为-谷氨酰基的供体，双甘肽谷氨酰基的供体，双甘肽作为受体，在作为受体，在GGTGGT作用下，产生作用下，产生-萘胺萘胺，后者与重氮试剂，后者与重氮试剂反应，产生反应，产生红色红色-萘胺

49、萘胺-对对-偶氮苯磺酸偶氮苯磺酸，其色泽的深浅与，其色泽的深浅与GGTGGT活力成正比。活力成正比。一、重氮反应比色法一、重氮反应比色法 原理原理第五十二页，本课件共有132页试剂与器材1.150mmol/L双甘肽溶液2.1mol/L HCL3.底物缓冲液4.2g/L 对氨基苯磺酸醋酸溶液5.1.0g/L 亚硝酸钠溶液6.显色剂7.1.5mmol/L a-萘胺标准贮存液8.0.15mmol/L a-萘胺标准应用液9.器材 试管、恒温水浴箱、刻度吸管、微量移液器、分光光度计、坐标纸。第五十三页，本课件共有132页实践步骤实践步骤加入物（ml）测定管 对照管血清 0.05 -底物缓冲液 0.5 0

50、.5 混匀，在37恒温水浴箱中保温15min显色剂 0.5 0.5血清 -0.05 混匀后，置37水浴保温10min，用分光光度计在波长530nm处，以对照管调零，读取各管吸光度。第五十四页，本课件共有132页参考范围：参考范围：成年男性成年男性 317317U/L 成年女性成年女性 213213U/L第五十五页，本课件共有132页 测定方法测定方法 一、速率法一、速率法以以L-L-谷氨酰谷氨酰-3-3-羧基羧基-4-4-硝基苯胺硝基苯胺为底物，双甘肽为谷氨酰为底物，双甘肽为谷氨酰基的受体，在基的受体，在GGTGGT的催化下，谷氨酰基转移到双甘肽分子上，的催化下，谷氨酰基转移到双甘肽分子上，同