有机磷降解酶在烟草中的高效表达学习教案.pptx

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1、会计学1有机磷降解酶在烟草中的高效有机磷降解酶在烟草中的高效(o xio)表达表达第一页，共24页。有机磷化合物有机磷化合物n n有机磷化合物在农业生产中作为杀虫剂被广泛使用，长期以来，有机磷农药使用量大、影响范围广、极易造成大面积污染，因而带来了环境(hunjng)问题：n n 一是污染大气、水环境(hunjng)，造成土壤板结n n 二是增强病菌、害虫对农药的抗药性n n 三是杀伤有益生物n n 四是农药对人体健康造成危害第1页/共24页第二页，共24页。有机磷农药(nngyo)有机磷农药(nngyo)造成水污染有机磷农药(nngyo)中毒土壤板结第2页/共24页第三页，共24页。有机磷降

2、解有机磷降解(jin ji)酶酶n n有机磷降解酶有机磷降解酶ophc2，主要来源，主要来源于来源于假产碱假单胞菌等微于来源于假产碱假单胞菌等微生物。是目前公认的能有效生物。是目前公认的能有效(yuxio)降解有机磷化合物的降解有机磷化合物的手段，尤其是对有机磷农药残手段，尤其是对有机磷农药残留等造成的污染的改善。留等造成的污染的改善。n n因此，利用基因工程方法，将因此，利用基因工程方法，将ophc2在植物中表达，具有很大在植物中表达，具有很大的应用前景的应用前景第3页/共24页第四页，共24页。植物转基因技术的一般植物转基因技术的一般(ybn)步骤步骤n n 目的基因目的基因(jyn)的获

3、取的获取n n 表达载体的构建表达载体的构建n n 目的基因目的基因(jyn)的转化的转化n n 筛选阳性克隆筛选阳性克隆n n 植株再生植株再生第4页/共24页第五页，共24页。有机磷降解有机磷降解(jin ji)酶基因的酶基因的获取获取n n将来源于假产碱假单胞菌的有机磷降解酶将来源于假产碱假单胞菌的有机磷降解酶将来源于假产碱假单胞菌的有机磷降解酶将来源于假产碱假单胞菌的有机磷降解酶OPHC2OPHC2OPHC2OPHC2进进进进行了行了行了行了N N N N端及内肽的氨基酸序列测定，根据得到的氧端及内肽的氨基酸序列测定，根据得到的氧端及内肽的氨基酸序列测定，根据得到的氧端及内肽的氨基酸序

4、列测定，根据得到的氧基酸序列设计合成了简并引物，通过基酸序列设计合成了简并引物，通过基酸序列设计合成了简并引物，通过基酸序列设计合成了简并引物，通过PCRPCRPCRPCR和反向和反向和反向和反向PCRPCRPCRPCR从中克隆从中克隆从中克隆从中克隆(k ln)(k ln)(k ln)(k ln)出有机磷降解酶基因出有机磷降解酶基因出有机磷降解酶基因出有机磷降解酶基因ophc2ophc2ophc2ophc2编码基因全长编码基因全长编码基因全长编码基因全长975bp975bp975bp975bpn n 引物：引物：引物：引物：PrimerF PrimerF PrimerF PrimerF(5T

5、ACGTAACCATGGCCGCACCGGCACAACAGAAG(5TACGTAACCATGGCCGCACCGGCACAACAGAAG(5TACGTAACCATGGCCGCACCGGCACAACAGAAG(5TACGTAACCATGGCCGCACCGGCACAACAGAAG一一一一3)3)3)3)n n PrimerR PrimerR PrimerR PrimerR n n (5GAGCTCATCAGCGCTCGCTACGGATCGG 3)(5GAGCTCATCAGCGCTCGCTACGGATCGG 3)(5GAGCTCATCAGCGCTCGCTACGGATCGG 3)(5GAGCTCATCA

6、GCGCTCGCTACGGATCGG 3)第5页/共24页第六页，共24页。表达表达(biod)载体的构建载体的构建n n将目的将目的(md)基因体外重组到基因体外重组到适当的已改造的质粒中，包括：适当的已改造的质粒中，包括：n n保存用中间载体：保存用中间载体：pBR322、pUCn n繁殖载体：繁殖载体：JM109,TOP10n n植物转化载体（农杆菌寄主）：植物转化载体（农杆菌寄主）：pBI121等等第6页/共24页第七页，共24页。分离(fnl)基因克隆(k ln)到某中间载体转化(zhunhu)大肠杆菌提取质粒限制酶切/连接克隆到植物表达载体转化农杆菌基因枪转化pGEM-TJM109

7、pBI121LBA4404,EHA第7页/共24页第八页，共24页。Ophc2基因表达载体基因表达载体(zit)的构建的构建n n将将将将ophc2ophc2ophc2ophc2基因片段克隆到基因片段克隆到基因片段克隆到基因片段克隆到pGEM-T EasypGEM-T EasypGEM-T EasypGEM-T Easy载体上，测序正确载体上，测序正确载体上，测序正确载体上，测序正确后后后后 ，用，用，用，用SnaBISnaBISnaBISnaBI和和和和SacISacISacISacI消化得到消化得到消化得到消化得到(d do)(d do)(d do)(d do)目的片段，连接目的片段，连接

8、目的片段，连接目的片段，连接到含有到含有到含有到含有extensinextensinextensinextensin序列的序列的序列的序列的 T easy-E T easy-E T easy-E T easy-EGFPGFPGFPGFP载体上，命名为载体上，命名为载体上，命名为载体上，命名为pTeasy-ophc2pTeasy-ophc2pTeasy-ophc2pTeasy-ophc2，extensinextensinextensinextensin可帮助蛋白表达到胞外。用可帮助蛋白表达到胞外。用可帮助蛋白表达到胞外。用可帮助蛋白表达到胞外。用SacISacISacISacI和和和和 XbaI

9、 XbaI XbaI XbaI从从从从 pTeasy-ophc2 pTeasy-ophc2 pTeasy-ophc2 pTeasy-ophc2上切下连接了上切下连接了上切下连接了上切下连接了extensinextensinextensinextensin基基基基 因序列的因序列的因序列的因序列的 ophc2 ophc2 ophc2 ophc2，连接到，连接到，连接到，连接到 pBI121 pBI121 pBI121 pBI121上获得上获得上获得上获得 ophc2 ophc2 ophc2 ophc2最终表最终表最终表最终表达框，包含达框，包含达框，包含达框，包含 CaMV 35S CaMV 3

10、5S CaMV 35S CaMV 35S启动子序列、启动子序列、启动子序列、启动子序列、extensinextensinextensinextensin序列、序列、序列、序列、ophc2ophc2ophc2ophc2基因和基因和基因和基因和nosnosnosnos终止子序列，命名为终止子序列，命名为终止子序列，命名为终止子序列，命名为 pBI-E-ophc2 pBI-E-ophc2 pBI-E-ophc2 pBI-E-ophc2，转，转，转，转化大肠杆菌化大肠杆菌化大肠杆菌化大肠杆菌JM109JM109JM109JM109。第8页/共24页第九页，共24页。目的基因的农杆菌目的基因的农杆菌(g

11、njn)转化转化n n从从 Ecoli JM109中大量中大量(dling)提取质粒提取质粒 pBIE ophc2的的 DNA，电击法转化，电击法转化 Agrobacterium LBA 4404，菌落，菌落 PCR鉴定阳性克隆，叶盘法转鉴定阳性克隆，叶盘法转化烟草化烟草 第9页/共24页第十页，共24页。农杆菌农杆菌(gnjn):used extensively for genetic engineering of plants.包含包含Ti质粒质粒 Tumor inducing plasmid(bacterial plasmid)T-DNA(Transferred-DNA),可以转移进入植

12、物可以转移进入植物基因组基因组.Tumor induced byA.tumefaciens第10页/共24页第十一页，共24页。Ti PlasmidT-DNA regionLeft borderRight bordervir genesori已知农杆菌附着(fzhu)到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。auxin第11页/共24页第十二页，共24页。农杆菌(gnjn)共培养侵染诱导(yudo)愈伤组织分化(fnhu)生芽生根叶盘转化法(1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。第12页/共24页第十三页，共24页。转基因植株转基因植

13、株(zhzh)的的PCR检测检测 以转基因植株叶片所提取的总以转基因植株叶片所提取的总 DNA为模板，进行为模板，进行 PCR扩增，扩增，得到约得到约 1 kb的特异性扩增条带，的特异性扩增条带，而野生型植株而野生型植株 中未产生该片段中未产生该片段。证。证 明明 ophc2整合整合(zhn h)到到基因组中。在基因组中。在 101株转化植株中，株转化植株中，有有 80株株 PCR检测呈阳性检测呈阳性 第13页/共24页第十四页，共24页。第14页/共24页第十五页，共24页。Western杂交杂交(zjio)检测检测 从从 80株株 PCR检测阳性检测阳性(yngxng)的转基因植株中随机的

14、转基因植株中随机 挑选挑选 60株提取植株的总蛋白，株提取植株的总蛋白，western杂交，结果有杂交，结果有 24株植株株植株呈阳性呈阳性(yngxng)，初步证实该，初步证实该基因已在植物中得到表达基因已在植物中得到表达第15页/共24页第十六页，共24页。第16页/共24页第十七页，共24页。Ophc2酶活性检测酶活性检测(jin c)在胞外表达信号肽的引导下，在胞外表达信号肽的引导下，该基因蛋白产物应分泌到胞外，该基因蛋白产物应分泌到胞外，因此在培养转基因植物因此在培养转基因植物(zhw)的的液体培养基中会存在液体培养基中会存在OPHC2，取，取液体培养基浓缩后作为酶液，以液体培养基浓缩后作为酶液，以甲基对硫磷为底物测定酶活性，甲基对硫磷为底物测定酶活性，可证实该外源基因的成功表达可证实该外源基因的成功表达第17页/共24页第十八页，共24页。第18页/共24页第十九页，共24页。讨论讨论(toln)n n转基因植物的潜在危害(wihi)n n其他转基因植物的研究第19页/共24页第二十页，共24页。第20页/共24页第二十一页，共24页。第21页/共24页第二十二页，共24页。第22页/共24页第二十三页，共24页。第23页/共24页第二十四页，共24页。