核酸杂交技术全解学习教案.pptx

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1、会计学1核酸杂交核酸杂交(zjio)技术全解技术全解第一页，共63页。目目 录录第一节第一节第一节第一节 核酸分子杂交的概念核酸分子杂交的概念核酸分子杂交的概念核酸分子杂交的概念一、核酸探针一、核酸探针一、核酸探针一、核酸探针二、分子杂交信号二、分子杂交信号二、分子杂交信号二、分子杂交信号(xnho)(xnho)(xnho)(xnho)检测检测检测检测第二节第二节第二节第二节 经典的核酸分子杂交技术经典的核酸分子杂交技术经典的核酸分子杂交技术经典的核酸分子杂交技术一、固相杂交一、固相杂交一、固相杂交一、固相杂交二、液相杂交二、液相杂交二、液相杂交二、液相杂交第1页/共62页第二页，共63页。目

2、目 录录第四节第四节 影响杂交信号检测的因素影响杂交信号检测的因素一、探针一、探针(tn zhn)(tn zhn)的选择的选择二、探针二、探针(tn zhn)(tn zhn)的标记方法的标记方法三、探针三、探针(tn zhn)(tn zhn)的浓度的浓度四、杂交率四、杂交率五、杂交温度五、杂交温度六、杂交的严格谨性六、杂交的严格谨性七、杂交反应时间七、杂交反应时间八、杂交促进剂八、杂交促进剂第2页/共62页第三页，共63页。核酸核酸(h sun)(h sun)分子杂交分子杂交(molecular hybridization of nucleic acid)(molecular hybridiz

3、ation of nucleic acid)核核酸酸分分子子杂杂交交：单单链链的的核核酸酸分分子子在在合合适适的的条条件件下下，与与具具有有碱碱基基互互补补序序列列的的异异源源核核酸酸形形成成双双链链杂交体的过程。杂交体的过程。核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术：利利用用核核酸酸分分子子杂杂交交检检测测靶靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。序列的一类技术称核酸分子杂交技术。核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术目目前前应应用用广广泛泛，是是定定性性或或定定量量检检测测特特异异RNARNA或或DNADNA序序列列片片段段的的有有力力(yul)(yul)工具。工具。第3页/共62页第四页，共63页。第一节

4、第一节 核酸分子杂交核酸分子杂交(zjio)(zjio)的的概念概念变性变性 退火退火(tu hu)(tu hu)复性复性第4页/共62页第五页，共63页。核酸(h sun)分子杂交的基本原理1 1、变性（、变性（denaturationdenaturation）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成(xngchng)(xngchng)无规则线团，双链解链成为单链。无规则线团，双链解链成为单链。第5页/共62页第六页，共63页。2 2 2 2、融解、融解、融解、融解(rngji)(rngji)(rngji)(rngj

5、i)温度温度温度温度(Melting Temperature,Tm)(Melting Temperature,Tm)(Melting Temperature,Tm)(Melting Temperature,Tm)定义：在定义：在定义：在定义：在DNADNADNADNA热变性时，其热变性时，其热变性时，其热变性时，其A260A260A260A260的升高达最大值一半时的温度。的升高达最大值一半时的温度。的升高达最大值一半时的温度。的升高达最大值一半时的温度。影响影响TmTm的因素：的因素：（1 1）DNADNA碱基的组成碱基的组成 G-C G-C含量越多含量越多 Tm Tm值越高值越高 A-T

6、A-T含量越多含量越多 Tm Tm值越低值越低 （2 2）溶液的离子强度）溶液的离子强度 低离子强度低离子强度 Tm Tm值越低值越低 高离子强度高离子强度 Tm Tm值越高值越高 （3 3）pHpH值值 pH pH值值5-9 Tm5-9 Tm值变化不值变化不明显明显(mngxin)(mngxin)pH11 pH11 不利于氢键不利于氢键形成形成 （4 4）变性剂）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形干扰碱基堆积力和氢键的形成成第6页/共62页第七页，共63页。3.3.复性复性 变性变性DNADNA经过一定处理重新形成经过一定处理重新形成(xngchng)(xngchng)双螺旋的双螺旋的过程。过

7、程。影响复性速度的因素：影响复性速度的因素：DNA DNA浓度浓度 DNA DNA片段的大小片段的大小 DNA DNA片段复杂性片段复杂性 合适合适(hsh)(hsh)的复性温度的复性温度 适当的离子强度适当的离子强度第7页/共62页第八页，共63页。重点重点(zhngdin)提示提示 分子杂交：指具有一定同源序列的两分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（条核酸单链（DNADNA或或RNARNA），在一），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。利用火处理，形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用这一原理，就可以使用(shyng

8、)(shyng)已知序列的单链核酸片段作为探针，已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组去查找各种不同来源的基因组DNADNA分子中的同源基因或同源序列。分子中的同源基因或同源序列。第8页/共62页第九页，共63页。一、核酸一、核酸(h sun)(h sun)探针探针 核酸探针指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能由其标记(bioj)被特异性检测的核酸分子。第9页/共62页第十页，共63页。探针探针(tn(tn zhn)zhn)的种类的种类寡核苷酸探针寡核苷酸探针(tn(tn zhn)zhn)基因组基因组DNADNA探针探针(tn zhn)(tn zhn)cDNAcDNA探针

9、探针RNARNA探针探针DNADNA探针探针（一一）常用探针的种类）常用探针的种类第10页/共62页第十一页，共63页。1.DNA探针探针 最常用最常用(chn yn)的核酸探针的核酸探针三大优点：三大优点：这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限(wxin)(wxin)繁殖，制备方法简便；繁殖，制备方法简便；DNA DNA探针相对不易被降解，一般探针相对不易被降解，一般DNADNA酶活性能有效酶活性能有效地被抑制；地被抑制；DNA DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、如缺口平移

10、法、随机引物法、PCRPCR标记法等，能用于放标记法等，能用于放射性核素和非放射性物质标记。射性核素和非放射性物质标记。第11页/共62页第十二页，共63页。2.RNA探针探针(tn zhn)优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少，未杂交探针可用交较少，未杂交探针可用RNase RNase 降解，减少降解，减少本底的干扰。本底的干扰。缺点缺点(qudin)(qudin)：易降解，标记方法复杂：易降解，标记方法复杂 。第12页/共62页第十三页，共63页。3.3.寡核苷酸探针寡核苷酸探针(tn zhn)(tn zhn)寡核苷酸探针一般由寡核苷酸探针一般

11、由17175050个核苷酸组成。个核苷酸组成。优势：可以区分仅仅优势：可以区分仅仅(jnjn)(jnjn)一个碱基差别一个碱基差别的靶序列；的靶序列；缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针杂交的特异性。杂交的特异性。第13页/共62页第十四页，共63页。（二）探针（二）探针(tn zhn)(tn zhn)的长度的长度1.DNA和和RNA探针探针 DNA探针通常探针通常(tngchng)为为400500个碱基个碱基2.寡核苷酸探针寡核苷酸探针 探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性

12、探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性第14页/共62页第十五页，共63页。（三）核酸探针（三）核酸探针(tn zhn)(tn zhn)的标记的标记 1.1.探针标记物的选择探针标记物的选择(xunz)(xunz)（1 1）放射性标记）放射性标记（2 2）非放射性标记）非放射性标记根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。端标记探针。第15页/共62页第十六页，共63页。不同不同(b tn)(b tn)标记类型探针的比较：标记类型探针的比较：优点优点缺点缺点放射性探放射性探针针可以准确定量；灵可以准确定量；灵敏度高；本底低；敏度高；本底低；易于除去旧探针

13、易于除去旧探针,重新杂交新探针重新杂交新探针短半衰期的探针需临用短半衰期的探针需临用前制备；放射性递减使前制备；放射性递减使探针降解；放射性物质探针降解；放射性物质对人体有害；费用贵对人体有害；费用贵非放射性非放射性探针探针对人体危害小；稳对人体危害小；稳定，可供长时间内定，可供长时间内持续使用；检测过持续使用；检测过程快；可同时进行程快；可同时进行不同标记探针的杂不同标记探针的杂交；本底较低交；本底较低灵敏度不如放射性探针；灵敏度不如放射性探针；杂交条件受报告基团的杂交条件受报告基团的限制；重新杂交新探针限制；重新杂交新探针比较困难比较困难第16页/共62页第十七页，共63页。2.2.2.2

14、.探针探针探针探针(tn zhn)(tn zhn)(tn zhn)(tn zhn)标记方法的选择标记方法的选择标记方法的选择标记方法的选择 制备探针步骤制备探针步骤(bzhu)(bzhu)：探针标记探针标记清除未标记的核酸探针清除未标记的核酸探针检测探针标记效率检测探针标记效率 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法(1)DNA(1)DNA切口平移标记法切口平移标记法(2)DNA(2)DNA随机引物标记法随机引物标记法(3)DNA(3)DNA的末端标记的末端标记(7)RNA(7)RNA探针的标记探针的标记(4)cDNA(4)cDNA探针的标记探针的标记(5)(5)寡核苷酸探针的标记寡核苷酸探针的

15、标记(6)(6)单链单链DNADNA探针的标记探针的标记第17页/共62页第十八页，共63页。随机引物：含有各种随机引物：含有各种(zhn)zhn)可能排列顺序的寡可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。核苷酸片段的混合物。DNADNA聚聚 合合 酶酶 KlenowKlenow片片 段段(pin(pin dun)dun)：保保 留留53DNA53DNA聚聚合合酶酶活活性性,弱弱3535外外切切酶酶活活性性，无无5353外切酶活性。外切酶活性。（1 1）DNADNA随机随机(su j)(su j)引物标记引物标记第18页/共62页第十九页，共63页。5 3 3 5 32P-部分标记部分标记(bioj

16、)的单的单链链DNA片段片段切口切口原始原始位置位置切口切口最终最终位置位置32P-标记的标记的DNADNA聚合酶聚合酶I-32P-dCTP变性变性DNase I，Mg2+dATP，dGTP，dTTPDNADNA酶酶：在在双双链链DNADNA上上随随机机打打开开(d(d ki)ki)若若干干个个单单链缺口，产生链缺口，产生3-OH3-OH端。端。大大 肠肠 杆杆 菌菌(d(d chn chn n n jn)DNAjn)DNA聚聚合合酶酶：53DNA53DNA聚聚 合合 酶酶活活性性；53 53 外外切切核酸酶活性。核酸酶活性。（2 2）DNADNA切口平移标记切口平移标记第19页/共62页第二

17、十页，共63页。条件条件(tiojin)(tiojin)是有是有5-OH5-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链双链DNADNA需用碱性磷酸酶切除需用碱性磷酸酶切除5-P5-P后再标记后再标记55p-HOp-HO-CpGpTpA3-CpGpTpA355HO-HO-CpGpTpA3CpGpTpA3T4T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶(jmi)(jmi)-3232P-ATPP-ATP553232p p-O-CpGpTpA3-O-CpGpTpA33737，反应，反应(fnyng)10min,-32P-ATP(fnyng)10min,-32P-ATP 需需150

18、 ci/150 ci/反应反应(fnyng)(fnyng)1)DNA1)DNA的的55末端标记末端标记碱性磷酸酶碱性磷酸酶(3)DNA(3)DNA的末端标记的末端标记第20页/共62页第二十一页，共63页。5335完整完整(wnzhng)(wnzhng)双链双链DNADNA限制性内切酶限制性内切酶5335-3232P-dNTPP-dNTP其他其他(qt)3(qt)3 种种dNTPdNTPKlenow DNAKlenow DNA聚合酶聚合酶5335变性533555末端末端(m(m dun)dun)突出的突出的DNADNA33末端标记的末端标记的DNADNA3232P-P-末端标记的单末端标记的单

19、链链DNADNA探针探针2)DNA2)DNA的的33末端标记末端标记第21页/共62页第二十二页，共63页。二、分子杂交信号二、分子杂交信号(xnho)(xnho)检测检测（一）放射性标记探针（一）放射性标记探针(tn zhn)检测检测1、放射自显影、放射自显影2、液体闪烁计数法、液体闪烁计数法（二）非放射性标记探针（二）非放射性标记探针(tn zhn)的杂交的杂交检测检测1、酶促显色检测、酶促显色检测2、荧光检测、荧光检测3、化学发光检测、化学发光检测4、多探针、多探针(tn zhn)检测检测第22页/共62页第二十三页，共63页。（一）放射性标记（一）放射性标记(bioj)(bioj)探针

20、检测探针检测1.1.放射自显影放射自显影 放射性杂交的检测基于放射性核素释放的能放射性杂交的检测基于放射性核素释放的能量将照片量将照片(zhopin)(zhopin)纸感光的原理。纸感光的原理。用用32P32P标记杂交最常用的检测方法是放射自标记杂交最常用的检测方法是放射自显影。显影。第23页/共62页第二十四页，共63页。2.2.液体液体(yt)(yt)闪烁计数法闪烁计数法 液体闪烁计数法的工作原理是被测样液体闪烁计数法的工作原理是被测样品辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪品辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪烁剂分子，当被激发的闪烁剂分子从激发烁剂分子，当被激发的闪烁剂分子从激发态退激为稳态

21、时，以荧光光子的形式辐射态退激为稳态时，以荧光光子的形式辐射能量，经光电倍增能量，经光电倍增(bi zn)管放大并被管放大并被测量，就可以实现对放射性核素的测定。测量，就可以实现对放射性核素的测定。第24页/共62页第二十五页，共63页。（二）非放射性标记（二）非放射性标记(bioj)(bioj)探针的杂交检探针的杂交检测测 1.1.酶促显色检测酶促显色检测（1 1）直接检测）直接检测酶本身作为标记分子掺入到核酸中去，在洗脱酶本身作为标记分子掺入到核酸中去，在洗脱(x tu)(x tu)后就可直接进行检测。后就可直接进行检测。酶直接作用于显色的底物，产生颜色沉淀，显色沉淀可酶直接作用于显色的底

22、物，产生颜色沉淀，显色沉淀可用肉眼检测。用肉眼检测。酶直接作用于化学发光的底物发光酶直接作用于化学发光的底物发光,发光的检测要依赖发光的检测要依赖于对蓝光敏感的于对蓝光敏感的X X胶片。胶片。这种检测法常用于寡核苷酸探针杂交，这类杂交反应温这种检测法常用于寡核苷酸探针杂交，这类杂交反应温度低。度低。第25页/共62页第二十六页，共63页。碱性碱性(jin xn)(jin xn)磷酸酶显色反应示意图磷酸酶显色反应示意图第26页/共62页第二十七页，共63页。HRPHRP酶显色酶显色(xin s)(xin s)反应示意图反应示意图(DAB)(TMB)第27页/共62页第二十八页，共63页。Dig：

23、半抗原：半抗原(kngyun)，可通过抗原，可通过抗原(kngyun)抗体反应系统抗体反应系统与显色体系偶联与显色体系偶联Dig-DNADig-DNA探针探针+抗抗DigDig抗体抗体-碱碱性磷酸酶（或性磷酸酶（或辣根过氧化物辣根过氧化物(u yn(u yn hu w)hu w)酶）酶）+底物底物（2）间接）间接(jin ji)检测检测 检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时，检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时，就要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。就要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。第28页/共62页第二十九页，共63页。荧光素：一类荧光素：一类(y li)(y li)

24、能在激发光作用下发射出荧光的物质能在激发光作用下发射出荧光的物质 荧光显微镜观察、免疫组织化学法荧光显微镜观察、免疫组织化学法 2 2荧光荧光(ynggung)(ynggung)检测检测 第29页/共62页第三十页，共63页。n n化化学学发发光光是是指指化化学学反反应应中中释释放放的的能能量量以以光光的的形形式式发发射出来形成检测信号。射出来形成检测信号。n n化化学学发发光光酶酶免免疫疫技技术术中中目目前前常常用用的的酶酶有有碱碱性性磷磷酸酸酶酶及辣根过氧化物酶及辣根过氧化物酶n n发发射射光光线线的的强强度度反反映映(fnyng)(fnyng)了了酶酶的的活活性性，反反应应了了杂化分子的

25、量。杂化分子的量。3化学发光底物(d w)辣根过氧化物酶催化辣根过氧化物酶催化(cu hu)的化学发光反应的化学发光反应第30页/共62页第三十一页，共63页。n n采用发色体检测的最大益处是可同时检测一个以上的杂采用发色体检测的最大益处是可同时检测一个以上的杂化分子化分子n n每种探针分别用不同每种探针分别用不同(b tn)(b tn)的报告基团如生物素、的报告基团如生物素、荧光素和地高辛标记并同时与固定在滤膜上的核酸杂交荧光素和地高辛标记并同时与固定在滤膜上的核酸杂交n n采用不同采用不同(b tn)(b tn)的链霉抗生素或抗体的链霉抗生素或抗体-酶和相应底物酶和相应底物组合组合4 4多

26、探针多探针(tn zhn)(tn zhn)检测检测 第31页/共62页第三十二页，共63页。第二节第二节 经典的核酸分子经典的核酸分子(fnz)(fnz)杂交技杂交技术术第32页/共62页第三十三页，共63页。核酸分子核酸分子核酸分子核酸分子(fnz(fnz)杂交分类杂交分类杂交分类杂交分类根据杂交根据杂交(zjio)(zjio)核酸分子的种类核酸分子的种类 DNA DNA与与DNADNA杂交杂交(zjio)(zjio)DNA DNA与与RNARNA杂交杂交(zjio)(zjio)RNA RNA与与RNARNA杂交杂交(zjio)(zjio)根据根据(gnj)杂交探针标记杂交探针标记 同位素杂

27、交同位素杂交 非同位素杂交非同位素杂交根据根据杂交介质杂交介质 液相杂交液相杂交 固相杂交固相杂交 原位杂交原位杂交菌落杂交菌落杂交Southern印迹杂交印迹杂交Northern印迹杂交印迹杂交点杂交点杂交狭缝杂交狭缝杂交第33页/共62页第三十四页，共63页。分子杂交技术分子杂交技术(jsh)一般过程一般过程 探针探针探针探针(tn zhn)(tn zhn)制备及标记（同位素或非同位素）制备及标记（同位素或非同位素）制备及标记（同位素或非同位素）制备及标记（同位素或非同位素）待测核酸样品制备（分离，纯化）待测核酸样品制备（分离，纯化）待测核酸样品制备（分离，纯化）待测核酸样品制备（分离，纯

28、化）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）显示结果（显色，发光，放射自显影）显示结果（显色，发光，放射自显影）显示结果（显色，发光，放射自显影）显示结果（显色，发光，放射自显影）结果分析结果分析结果分析结果分析第34页/共62页第三十五页，共63页。固相杂交固相杂交(zjio)：先将待测单链核酸样品结合到固相支持物（常用有硝酸纤先将待测单链核酸样品结合到固相支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、

29、化学活化膜等）上，然后与溶液中的维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记已知序列的标记(bioj)(bioj)探针进行杂交，放射自显影分析探针进行杂交，放射自显影分析杂交结果。杂交结果。第35页/共62页第三十六页，共63页。（一）反向（一）反向(fn xin)(fn xin)点杂交点杂交反向点杂交（反向点杂交（reverse dot blot,RDBreverse dot blot,RDB）是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品(yngpn)DNA(yngpn)DNA又互不干扰，又互不干扰，故能一次性筛查出多故能一

30、次性筛查出多种不同的序列。种不同的序列。特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好较较Northern blotNorthern blot省去了电泳和毛细转膜过程省去了电泳和毛细转膜过程第36页/共62页第三十七页，共63页。（二）（二）Southern印迹杂交印迹杂交 Southern印迹杂交(zjio)（Southern blot hybridization/Southern blotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交(zjio)。可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。第37页/共62页第三十八页，共63页。（二）（二）Sout

31、hern印迹杂交印迹杂交包括两个主要过程：包括两个主要过程：将待测定核酸将待测定核酸(h sun)(h sun)分子通过一定的方法转移分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（膜）上，即印迹（blottingblotting）。）。固定于膜上的核酸固定于膜上的核酸(h sun)(h sun)与同位素标记的探针与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。第38页/共62页第三十九页，共63页。SouthernSouthern印迹杂交的基本印迹杂交的

32、基本(jbn)(jbn)步骤：步骤：待测待测DNADNA样品的限制性内切酶消化样品的限制性内切酶消化(xiohu)(xiohu)酶切酶切DNADNA样品的电泳分离样品的电泳分离 凝胶中凝胶中DNADNA的变性和的变性和SouthernSouthern转移转移 探针的制备探针的制备 Southern Southern杂交杂交 杂交结果的检测杂交结果的检测第39页/共62页第四十页，共63页。限制性内切酶消化限制性内切酶消化酶切酶切DNADNA样品的电泳分离样品的电泳分离凝胶中凝胶中DNADNA的的NaOHNaOH变变性性凝胶中凝胶中DNADNA分离带分离带SouthernSouthern印迹印迹

33、凝胶中凝胶中DNADNA带被带被转移到转移到NCNC膜上膜上标记探标记探针杂交针杂交探针杂交带曝光显探针杂交带曝光显影影第40页/共62页第四十一页，共63页。SouthernSouthern杂交杂交(zjio)(zjio)的应的应用用 应用应用单基因遗传病的基因诊断单基因遗传病的基因诊断(zhndun)(zhndun)基因点突变的检测基因点突变的检测临床应用用于下列疾病的产前诊断临床应用用于下列疾病的产前诊断(zhndun)(zhndun)镰型细胞贫血镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良假肥大型肌营养不良 血友病血友病 慢性进行

34、型舞蹈病慢性进行型舞蹈病第41页/共62页第四十二页，共63页。（三）（三）Northern印迹杂交印迹杂交Northern 印迹（印迹（Northern blot）杂交是应用杂交是应用DNA探针检测特异探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术的另一种膜上印迹技术(jsh)。此项技术此项技术(jsh)的原理和过程与的原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测印迹基本相同，只是检测的分子是的分子是RNA，可用来对组织或细，可用来对组织或细胞中的胞中的mRNA进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。第42页/共62页第四十三页，共63页。Northern杂交杂交(zjio)应用应用 1.R

35、NA病毒的检测病毒的检测2.基因基因(jyn)表达的检测表达的检测Northern印迹技术被认为是检测基因印迹技术被认为是检测基因(jyn)表达水平的金标准。表达水平的金标准。第43页/共62页第四十四页，共63页。二、液相杂交二、液相杂交(zjio)液相杂交液相杂交(zjio)是指待测核酸和探针都存是指待测核酸和探针都存在于杂交在于杂交(zjio)液中，探针与待测核酸在液体液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交环境中按照碱基互补配对形成杂交(zjio)分子分子的过程。的过程。第44页/共62页第四十五页，共63页。液相杂交液相杂交(zjio)一种研究最早且操作一种研究最早且

36、操作(cozu)简便的杂交类型。简便的杂交类型。原理和反应条件与固相杂交基本相同，仅是将待检测原理和反应条件与固相杂交基本相同，仅是将待检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应。的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应。液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较困难，液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较困难，同源与异源的同源与异源的DNA分子在杂交的过程中会发生竞争，分子在杂交的过程中会发生竞争，使得杂交结果的分析十分困难。使得杂交结果的分析十分困难。因此液相杂交应用较少因此液相杂交应用较少第45页/共62页第四十六页，共63页。三三、原位原位杂交杂交 应用核酸探针与组织或细胞中

37、的核酸应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则按碱基配对原则(yunz)(yunz)进行特异性结合形成进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织细胞化学或免疫组织化杂交体，然后应用组织细胞化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。的检测技术。第46页/共62页第四十七页，共63页。（一）基本（一）基本(jbn)(jbn)操作步骤：操作步骤：杂交前准备：保持细胞形态结构、保存核酸、杂交前准备：保持细胞形态结构、保存核酸、增加组织的通透性、减低增加组织的通透性、减低(jind)(jind)背景。背景。杂交：使探针与细胞中的把序列结

38、合。杂交：使探针与细胞中的把序列结合。杂交后处理：盐溶液的漂洗，以减少背景。杂交后处理：盐溶液的漂洗，以减少背景。显示：根据核酸探针标志物的种类选择相应显示：根据核酸探针标志物的种类选择相应的检测系统。的检测系统。第47页/共62页第四十八页，共63页。（二）原位杂交的应用（二）原位杂交的应用(yngyng)(yngyng)1.细胞遗传学分析细胞遗传学分析产前诊断产前诊断生殖医学中的应用生殖医学中的应用(yngyng)血液疾病中染色体易位的检测血液疾病中染色体易位的检测实体瘤研究实体瘤研究2.比较基因组杂交比较基因组杂交3.基因图谱绘制基因图谱绘制4.病原学检测病原学检测第48页/共62页第四

39、十九页，共63页。荧光荧光(ynggung)(ynggung)原位杂交原位杂交(FISH,(FISH,Fluorescence in situ Hybridization)Fluorescence in situ Hybridization)利用荧光标记的探针利用荧光标记的探针(tn zhn)(tn zhn)与待测标本与待测标本的核酸进行原位杂交，的核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异从而对染色体或基因异常的细胞、组织标本进常的细胞、组织标本进行检测和诊断行检测和诊断 第49页/共62页第五十页，共63页。核酸分

40、子核酸分子(fnz)杂交技术类型杂交技术类型 杂交类型杂交类型检测目的及范围检测目的及范围SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的膜上的DNADNA分子分子NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的膜上的RNARNA分子分子反向斑点杂交反向斑点杂交检测样品中的检测样品中的DNADNA或或RNARNA分子分子原位杂交原位杂交检测细胞或组织上的检测细胞或组织上的DNADNA或或RNARNA分子分子第50页/共62页第五十一页，共63页。第四节第四节 影响杂交影响杂交(z

41、jio)信号检测的因信号检测的因素素第51页/共62页第五十二页，共63页。在核酸杂交反应中影响杂交体形成因素较在核酸杂交反应中影响杂交体形成因素较多，主要有探针多，主要有探针(tn zhn)的选择、探针的选择、探针(tn zhn)的标记方法、探针的标记方法、探针(tn zhn)的浓度、的浓度、杂交率、杂交最适温度、杂交的严谨性、杂交杂交率、杂交最适温度、杂交的严谨性、杂交反应时间及杂交促进剂等。反应时间及杂交促进剂等。第52页/共62页第五十三页，共63页。一、探针一、探针(tn zhn)的选择的选择在大多数情况下，可以选择克隆的在大多数情况下，可以选择克隆的DNADNA或或cDNAcDNA

42、双链探针。双链探针。但是在有些情况下，必须选用但是在有些情况下，必须选用(xunyng)(xunyng)其其它类型的探针如寡核苷酸探针和它类型的探针如寡核苷酸探针和RNARNA探针。探针。第53页/共62页第五十四页，共63页。二、探针二、探针(tn zhn)的标记方法的标记方法探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求(yoqi)，如灵敏度和显示方法等。，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。

43、一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。第54页/共62页第五十五页，共63页。三、探针三、探针(tn zhn)的浓度的浓度随探针浓度随探针浓度(nngd)增加，杂交率也增加。增加，杂交率也增加。在较窄的范围内，随探针浓度在较窄的范围内，随探针浓度(nngd)增加，敏增加，敏感性增加。感性增加。探针浓度探针浓度(nngd)过低会降低杂交的灵敏度，过过低会降低杂交的灵敏度，过高又会增加背景的染色。高又会增加背景的染色。一般认为，最佳原则是应用与靶核苷酸探针达到最一般认为，最佳原则是应用与靶核苷酸探针达到最大结合度的最低探针浓度大结合度的最低探针浓度(nngd)。第55页/共62页第五十六页，

44、共63页。四、杂交四、杂交(zjio)率率传统杂交率分析主要用于传统杂交率分析主要用于DNADNA复性研究，在这种情复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度况下，探针和靶链在溶液中的浓度(nngd)(nngd)相同。相同。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度在液相，故其浓度(nngd)(nngd)不能精确计算。不能精确计算。第56页/共62页第五十七页，共63页。五、杂交五、杂交(zjio)温度温度理想理想(lxing)(lxing

45、)的情况是在杂交速率最大的温度的情况是在杂交速率最大的温度条件下进行杂交反应条件下进行杂交反应对对RNARNA：DNADNA杂交来说，最大速率的产生点为杂交来说，最大速率的产生点为TmTm值下值下10151015；在在DNADNA：DNADNA杂交中选择低于杂交中选择低于TmTm值值20252025的的杂交温度。杂交温度。第57页/共62页第五十八页，共63页。六、杂交六、杂交(zjio)的严谨性的严谨性 严谨性（严谨性（stringency)是指杂交体系避免非同源性是指杂交体系避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。程度。影响杂交

46、体稳定性的因素决定着杂交条件的严谨影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严谨性，一般认为在低于杂交体性，一般认为在低于杂交体Tm值值25时杂交最佳，时杂交最佳，所以所以(suy)首先要根据公式计算杂交体首先要根据公式计算杂交体Tm 值。值。通过调节通过调节 盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。所需的严格性。第58页/共62页第五十九页，共63页。七、杂交七、杂交(zjio)反应时间反应时间C0t1/2C0t1/2是杂交反应进行一半时杂化分子的浓度，是杂交反应进行一半时杂化分子的浓度，C0t1/2 C0t1/2越越大反应越快。大反应越快。复杂性复杂性

47、(complexity)(complexity)或者说序列的复杂性是指在或者说序列的复杂性是指在DNADNA或或RNARNA样品中不同序列的总长度，如果有机体中不存在重复样品中不同序列的总长度，如果有机体中不存在重复序列，序列，DNADNA的复杂性与其基因组长度相当的复杂性与其基因组长度相当(xingdng)(xingdng)。重复序列的复杂性与其单一拷贝的复杂性相当重复序列的复杂性与其单一拷贝的复杂性相当(xingdng)(xingdng)，和其重复次数无关。，和其重复次数无关。第59页/共62页第六十页，共63页。八、杂交八、杂交(zjio)促进剂促进剂惰性多聚体可用来促进惰性多聚体可用来

48、促进(cjn)250(cjn)250个碱基以上的探针的个碱基以上的探针的杂交率。杂交率。而短探针不需用促进而短探针不需用促进(cjn)(cjn)剂，因其复杂度低和分子量剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。小，短探针本身的杂交率就高。第60页/共62页第六十一页，共63页。Questions1.1.核酸分子杂交的基本原理。核酸分子杂交的基本原理。2.2.核酸探针的种类及其标记核酸探针的种类及其标记(bioj)(bioj)方法。方法。3.3.核酸探针的检测。核酸探针的检测。4.4.核酸分子杂交的传统方法。核酸分子杂交的传统方法。5.5.原位杂交概念、基本步骤及其应用。原位杂交概念、基本步骤及其应用。第61页/共62页第六十二页，共63页。感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第62页/共62页第六十三页，共63页。