大肠杆菌感受态细胞的制备与转化.ppt

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1、实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化与转化【实验目的】n n学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理与技术。n n学习大肠杆菌转化的原理与技术。【实验原理实验原理】n n在自然条件下在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中但在人工构建的质粒载体中,一一般缺乏此种转移所必需的般缺乏此种转移所必需的mobmob基因基因,因此不能自行因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。n n如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细如需将质

2、粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNADNA。受体。受体细胞经过一些特殊方法细胞经过一些特殊方法(如电击法如电击法,CaCl,CaCl2 2等化学试等化学试剂法剂法)的处理后的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的细胞膜的通透性发生了暂时性的改变改变,成为能允许外源成为能允许外源DNADNA分子进入的感受态细分子进入的感受态细胞胞(Compenent cells)(Compenent cells)。n n转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基

3、因工程等研究领域的基本实验技术。其原理是细菌处于0的CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面，经42短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。n n转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。n nCaCl2法是目前常用

4、的感受态细胞制备方法，简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)。n n本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUCm-T质粒（T-载体）共保温，实现转化。由于pUCm-T质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUCm-T，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUCmT。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。【设备、材料与试剂】n n一

5、、一、设备设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。n n二、二、材料材料 E.coli DH5菌株:R,M,Amp；pUCmT质粒DNA:购自上海生工生物工程有限公司。n n三、试剂 1.LB固体和液体培养基2.Amp母液3.含Amp的LB固体培养基4.SOC液体培养基5.0.1mol/L CaCl2溶液【实验步骤实验步骤】n n一、一、受体菌的培养受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5单菌落,接种于20 ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:

6、50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37振荡培养1-2小时至OD600 0.5左右。n n二、二、感受态细胞的制备感受态细胞的制备(CaCl2 法法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟，然后于4下5000 rpm离心10分钟。2、弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后，4下5000 rpm离心10分钟，弃去上清。3、每50 ml初始培养物用200 l预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。n n三、三、转化转化 1、取200l感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离心管

7、中，置冰上。2、加入连接产物10l，轻轻摇匀，冰上放置60分钟。3、42水浴中热击2分钟，热激后迅速置于冰上冷却2分钟。4、向管中加入800 l SOC液体培养基(不含Amp)，混匀后37振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。（其间可以将IPTG 7l和X-Gal 40 l涂布于预制的Amp平板上）。n n5、将上述菌液以3000 rpm离心20秒，弃大部分上清，用剩余的100l上清重悬菌体，涂布于含Amp的筛选平板上（已涂布IPTG 7l和X-Gal 40 l），正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养16-24小时。n

8、 n同时做两个对照同时做两个对照:对照组对照组1:1:以同体积的无菌双蒸水代替以同体积的无菌双蒸水代替DNADNA溶液溶液,其其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的的LBLB平板上应没有菌落出现。平板上应没有菌落出现。对照组对照组2:2:以同体积的无菌双蒸水代替以同体积的无菌双蒸水代替DNADNA溶液溶液,但但涂板时只取涂板时只取5l 5l 菌液涂布于不含抗生素的菌液涂布于不含抗生素的LBLB平板上平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。，此组正常情况下应产生大量菌落。n n附录：附录：n nLB液体培养基：胰蛋白胨1 酵母提取物0.5 NaCl

9、 1 用NaOH调pH至7.0，定容至1L，灭菌。n n含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。【注意事项注意事项】为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1、细胞生长状态和密度：最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。n n2、质粒的质量和浓度:用于转化

10、的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。n n3、试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。n n4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。【思考题】n n1、如何正确地设置连接和转化的各种对照？其意义何在？n n2、如何提高连接和转化的效率？