第4章-DNA复制、突变和损伤修复-药学分子生物学课件.ppt

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1、2023/5/26China Parmaceutical University5533第四章第四章 DNADNA的复制、突变、的复制、突变、损伤和修复损伤和修复第一节第一节 DNA的复制的复制第二节第二节 基因突变基因突变第三节第三节 DNA的修复系统的修复系统2023/5/26China Parmaceutical UniversityNature455,770-774(9 October 2008)|doi:10.1038/nature07312Sae2,Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processingEleni

2、 P.Mimitou1&Lorraine S.Symington1Department of Microbiology,Columbia University Medical Center,701 West 168th Street,New York,New York 10032,USADNA ends exposed after introduction of double-strand breaks(DSBs)undergo 53 nucleolytic degradation to generate single-stranded DNA,the substrate for bindin

3、g by the Rad51 protein to initiate homologous recombination.This process is poorly understood in eukaryotes,but several factors have been implicated,including the Mre11 complex(Mre11Rad50Xrs2/NBS1),Sae2/CtIP/Ctp1 and Exo1.Here we demonstrate that yeast Exo1 nuclease and Sgs1 helicase function in alt

4、ernative pathways for DSB processing.Novel,partially resected intermediates accumulate in a double mutant lacking Exo1 and Sgs1,which are poor substrates for homologous recombination.The early processing step that generates partly resected intermediates is dependent on Sae2.When Sae2 is absent,in ad

5、dition to Exo1 and Sgs1,unprocessed DSBs accumulate and homology-dependent repair fails.These results suggest a two-step mechanism for DSB processing during homologous recombination.First,the Mre11 complex and Sae2 remove a small oligonucleotide(s)from the DNA ends to form an early intermediate.Seco

6、nd,Exo1 and/or Sgs1 rapidly process this intermediate to generate extensive tracts of single-stranded DNA that serve as substrate for Rad51.2023/5/26China Parmaceutical University第一节第一节 DNA的复制的复制一、一、DNADNA复制的一般特征复制的一般特征二、二、DNADNA复制中的酶学复制中的酶学三、原核生物的三、原核生物的DNADNA复制复制四、真核生物的四、真核生物的DNADNA复制复制2023/5/26Ch

7、ina Parmaceutical University需要清楚的几个概念需要清楚的几个概念复制子复制子(replicon)(replicon)l一个复制子是一个复制单位一个复制子是一个复制单位,包括复制所需的控制包括复制所需的控制元件、起始点和终点元件、起始点和终点;l复制子可以是线状也可以是环状复制子可以是线状也可以是环状;l细菌和病毒一个细菌和病毒一个DNADNA分子就是一个复制子分子就是一个复制子;l真核生物含有多个复制子真核生物含有多个复制子,两个起始点之间的两个起始点之间的DNADNA片片段就是一个复制子段就是一个复制子;复制叉复制叉(replication folk)(repli

8、cation folk)l复制时形成的复制时形成的Y Y行结构行结构2023/5/26China Parmaceutical University-replicon-单向复制单向复制双向复制双向复制Fused replicon2023/5/26China Parmaceutical University一、一、DNADNA复制的特征复制的特征1.1.半保留复制半保留复制2.2.半不连续复制半不连续复制3.3.DNADNA复制需要复制需要RNARNA引物引发引物引发2023/5/26China Parmaceutical University1.半保留复制半保留复制 2023/5/26China

9、 Parmaceutical University3.DNA3.DNA复制需要复制需要RNARNA引物引发引物引发DNADNA聚合酶不能起始聚合酶不能起始DNADNA的合成，必须有的合成，必须有RNARNA引物。引物。引出问题：复制完成后引出问题：复制完成后DNADNA链上会有链上会有RNARNA短片段短片段;3 3末端的缩短末端的缩短2023/5/26China Parmaceutical University二、二、DNADNA复制中的酶学复制中的酶学DNADNA复制时首先由解旋酶复制时首先由解旋酶 水解水解ATP,ATP,沿沿5 5 3 3方方向解开向解开DNADNA双链双链.E.col

10、iE.coli中基因中基因dnaB dnaB 编码的产物编码的产物DnaBDnaB蛋白是解旋酶蛋白是解旋酶1.1.解旋酶解旋酶 HelicaseHelicase2023/5/26China Parmaceutical University3.DNA 3.DNA 聚合酶聚合酶 DNA polymerase DNA polymerase 原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNADNA聚合酶不同。聚合酶不同。DNADNA聚合酶的共同特点是：聚合酶的共同特点是：（1 1）需要提供模板；）需要提供模板；（2 2）不能起始新的）不能起始新的DNADNA链链,必须要有引物提供必须要有引物提供3 3OHOH

11、；（3 3）合成）合成DNADNA的方向都是的方向都是5 533;（4 4）除聚合）除聚合DNADNA外还有其它功能。外还有其它功能。2023/5/26China Parmaceutical UniversityDNADNA聚合酶聚合酶的一般功能的一般功能:（1 1）5 533聚合功能聚合功能（2 2）3 355外切活性外切活性（3 3）5 533外切活性外切活性切口平移切口平移;链的置换；模板转换链的置换；模板转换 (4)(4)内切酶活性内切酶活性在原核生物DNA合成中,RNA引物的去除,修复由DNA聚合酶聚合酶完成完成.2023/5/26China Parmaceutical Univer

12、sityDNADNA聚合酶聚合酶的的5 533外切活性外切活性3 355外切活性外切活性内切酶活性内切酶活性2023/5/26China Parmaceutical UniversityDNA polymerase DNA polymerase 合成先导链和后随链的合成先导链和后随链的起始起始DNADNADNA polymerase DNA polymerase 先导链、后随链的延伸先导链、后随链的延伸DNA polymerase DNA repairDNA polymerase DNA repairDNA polymerase DNA repairDNA polymerase DNA rep

13、airDNA polymerase DNA polymerase 线粒体线粒体DNADNA的复制的复制真核生物的真核生物的DNA polymeraseDNA polymerase2023/5/26China Parmaceutical University4.4.拓扑异构酶拓扑异构酶 Topoisomerases Topoisomerases 无论原核生物还是真核生物中复制叉的移动和无论原核生物还是真核生物中复制叉的移动和转录的进行都需要拓扑异构酶转录的进行都需要拓扑异构酶.E.Coli E.Coli中有四种拓扑异构酶中有四种拓扑异构酶:Topoisomerase:Topoisomerase

14、I,I,和和 gyrase(gyrase(旋转酶旋转酶),),其中其中I I和和属属I I型型 (type I),(type I),和和 gyrasegyrase属于属于IIII型型(type II).gyrase(type II).gyrase将复制叉前的正超螺旋变成负超螺旋将复制叉前的正超螺旋变成负超螺旋,随后随后I I和和将将其消除其消除.真核生物中原理相同真核生物中原理相同.2023/5/26China Parmaceutical UniversityType I TopoisomeraseType I Topoisomerase 作用示意图作用示意图2023/5/26China Pa

15、rmaceutical University5.DNA5.DNA连接酶连接酶DNA合合成成中中冈冈崎崎片片段段之之间间及及所所有有Nick的的封闭由封闭由DNA连接酶完成连接酶完成;活活化化的的5PO4与与相相邻邻的的3OH作作用用形形成成35 磷酸二酯键，并释放出磷酸二酯键，并释放出AMP.2023/5/26China Parmaceutical University（一）复制原点：（一）复制原点：E.coliE.coli OriC OriC长约长约240bp,240bp,包括包括4 4个个9 9聚体，聚体，3 3个个1313聚体聚体.三、原核生物的三、原核生物的DNADNA复制过程复制过程

16、2023/5/26China Parmaceutical University1.1.复制的引发复制的引发 primingpriming2023/5/26China Parmaceutical University2.2.延伸延伸ElongationElongation先导链先导链后滞链后滞链2023/5/26China Parmaceutical University(三三)复制的复制的终止终止 TerminationTermination现已发现有两个终止区域（现已发现有两个终止区域（terE,D,AterE,D,A和和terC,BterC,B），），terter序列有一个序列有一个23b

17、p23bp的区域，在体外可导致复制的终的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。止，但其功能显示了一定的方向性。终止需要终止需要tustus(terminus utilization substance)(terminus utilization substance)基基因的产物因的产物Tus(36kD)Tus(36kD)，TusTus能识别能识别terter保守顺序，并保守顺序，并阻止复制叉继续前进。阻止复制叉继续前进。terter-Tus-Tus复合物可能通过抑制复合物可能通过抑制解旋酶来实行终止解旋酶来实行终止2023/5/26China Parmaceutical U

18、niversity四、真核生物四、真核生物DNADNA复制复制1.1.真核生物复制的起始序列真核生物复制的起始序列真核细胞以多个复制叉同时进行复制，哺乳乳真核细胞以多个复制叉同时进行复制，哺乳乳动物约动物约5 51010万个复制叉同时进行复制万个复制叉同时进行复制 复制的过程的本质在原核和真核生物是相同的复制的过程的本质在原核和真核生物是相同的,不不同的是起始的序列同的是起始的序列,参加的蛋白质的不同参加的蛋白质的不同,另外在具另外在具有端粒酶活性的细胞中存在线性末端的复制有端粒酶活性的细胞中存在线性末端的复制.2023/5/26China Parmaceutical University64

19、bp64bp核心序列含有：核心序列含有：4 4个个5 5GAGGC-3GAGGC-3 ，大，大T T抗原结合位点抗原结合位点,1,1个个15bp15bp回文序列回文序列 ;AT;AT组成的组成的17bp17bp区域区域SV40SV40病毒复制起始点病毒复制起始点2023/5/26China Parmaceutical University真核细胞真核细胞DNA复制的起始复制的起始2023/5/26China Parmaceutical University3.3.真核细胞真核细胞DNADNA复制的终止复制的终止端粒酶端粒酶催化作用下富含催化作用下富含G G的端粒的产生的端粒的产生.端粒合成的过

20、程端粒合成的过程:3 3端端DNADNA为引物，端粒酶自带为引物，端粒酶自带RNARNA模板，进行模板，进行结合、聚合、延伸、移位。结合、聚合、延伸、移位。2023/5/26China Parmaceutical UniversityGGG(TTAGGG)nCCC(AATCCC)n人人DNADNA端粒结构端粒结构重复单位重复单位重复次数重复次数2023/5/26China Parmaceutical UniversityGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAUGGGTTAGGGTTAGGGTTAAAUCCCAAU53端端

21、粒粒酶酶作作用用机机理理2023/5/26China Parmaceutical University五、噬菌体、病毒、质粒及线粒体核酸的复制五、噬菌体、病毒、质粒及线粒体核酸的复制(了解了解)双链双链DNADNA单股正链单股正链DNADNA双链双链RNARNA单股负链单股负链RNARNA单股正链单股正链RNARNA病毒病毒 核酸分子的正链与负链：核酸分子的正链与负链：与与mRNAmRNA相同的核酸链，称为正链；相同的核酸链，称为正链；与与mRNAmRNA互补的核酸链，称为负链。互补的核酸链，称为负链。2023/5/26China Parmaceutical University 这类病毒基因

22、组这类病毒基因组DNADNA复制的类型：复制的类型：（1 1）通过）通过DNADNA复制过程完成基因组复制。大多数复制过程完成基因组复制。大多数DNADNA病病毒基因组属这种类型。毒基因组属这种类型。（2 2）先转录生成）先转录生成RNARNA中间体，然后再通过逆转录过程中间体，然后再通过逆转录过程完成基因组的复制。如乙肝病毒（完成基因组的复制。如乙肝病毒（hepatitis B virus,HBVhepatitis B virus,HBV）。）。2023/5/26China Parmaceutical UniversityX174,M13X174,M13，质粒，质粒 滚环复制滚环复制 (1(

23、1）共价延伸；）共价延伸；（2 2）模板链和新合成的链）模板链和新合成的链 分开分开;（3 3）不需）不需RNARNA引物，在正引物，在正 链链3 3OHOH上延上延（4 4）只有一个复制叉）只有一个复制叉;2023/5/26China Parmaceutical University第一节第一节 DNA的复制的复制第二节第二节 基因突变基因突变第三节第三节 DNA的修复系统的修复系统2023/5/26China Parmaceutical University第二节第二节 基因突变基因突变 p133突变的概念突变的概念突变的类型突变的类型突变原因突变原因l自发突变自发突变l诱发突变诱发突变l

24、基因的人工诱变基因的人工诱变 体外定向突变体外定向突变 p1412023/5/26China Parmaceutical University第一节第一节 DNA的复制的复制第二节第二节 基因突变基因突变第三节第三节 DNA的修复系统的修复系统2023/5/26China Parmaceutical University第三节第三节 DNA的修复系统的修复系统一、复制修复一、复制修复 主要校正主要校正DNA复制过程产生的碱基错复制过程产生的碱基错误连接误连接,包括包括尿嘧啶糖基酶系统和错配修复尿嘧啶糖基酶系统和错配修复二、损伤修复二、损伤修复三、复制后修复三、复制后修复四、限制与修饰四、限制与

25、修饰2023/5/26China Parmaceutical University一、复制修复一、复制修复1.1.尿嘧啶糖基酶系统（尿嘧啶糖基酶系统（uracil N-glycosylase)uracil N-glycosylase)DNADNA中尿嘧啶的产生中尿嘧啶的产生:dUTP:dUTP 掺入和掺入和C C自发脱氨氧化成自发脱氨氧化成U U 修复修复:尿嘧啶尿嘧啶N-N-糖基酶，切断混合尿苷的糖苷键，形成糖基酶，切断混合尿苷的糖苷键，形成无无PuPu和和PyPy位点（位点（apurinic or apyrimidinicapurinic or apyrimidinic，APAP），），再

26、由再由APAP内切酶在内切酶在APAP位点切出一个缺口位点切出一个缺口,聚合酶聚合酶I I填补缺填补缺口，连接酶封闭口，连接酶封闭nicknick。2023/5/26China Parmaceutical University2.2.错配修复错配修复DNADNA错配修复基因是生物进化过程的保守基因错配修复基因是生物进化过程的保守基因,可维持基因组的稳定性可维持基因组的稳定性DNADNA复制产生复制产生1010-5-5错配率，其中错配率，其中99%99%被复制酶校被复制酶校正，剩下的正，剩下的1010-7 7由错配修复系统修复，最后实由错配修复系统修复，最后实际突变率只有际突变率只有1010-1

27、010 。问题：如何识别哪条是含有错误的新链，哪条问题：如何识别哪条是含有错误的新链，哪条是需要保留的母链？是需要保留的母链？2023/5/26China Parmaceutical UniversityMutMut蛋白识别错配碱基并在新链蛋白识别错配碱基并在新链GATC5GATC5端打开切口端打开切口,外切酶沿外切酶沿3 3 5 5方向切除含错配方向切除含错配DNADNA约约1kb,DNA1kb,DNA聚合聚合酶酶IIIIII全酶填补空缺，连接酶封闭切口，全酶填补空缺，连接酶封闭切口，damdam甲基化酶甲基化酶使新链甲基化。使新链甲基化。l母链上每母链上每250250bpbp有一个有一个G

28、ATCGATC，damdam甲基化酶识别其并在甲基化酶识别其并在A A上甲基化，子链甲基化程度晚些上甲基化，子链甲基化程度晚些 ，因此有了区别。，因此有了区别。错配修复机制错配修复机制修复系统由修复系统由mutS,mut L,mut HmutS,mut L,mut H编码的蛋白编码的蛋白,外切酶外切酶,DNA,DNA聚合酶全酶和连接酶共同组成聚合酶全酶和连接酶共同组成2023/5/26China Parmaceutical University3.3.无嘌呤修复无嘌呤修复2023/5/26China Parmaceutical University二、损伤修复二、损伤修复胸腺嘧啶二聚体的产生胸

29、腺嘧啶二聚体的产生2023/5/26China Parmaceutical University1.1.光复活（光复活（photoreactivationphotoreactivation）l 光复活酶在暗处与光复活酶在暗处与T T二聚体结合，蓝光下激活，二聚体结合，蓝光下激活，打开二聚体。打开二聚体。2.2.甲基转移酶甲基转移酶l鸟嘌呤被甲基化成为鸟嘌呤被甲基化成为O O6 6-G,O-G,O6 6-G-G甲基转移酶去除甲基转移酶去除甲基甲基3.3.切除修复（切除修复（excision repairexcision repair）将变形的损伤将变形的损伤DNADNA片段从双链分子除去片段从双

30、链分子除去,用正常的链用正常的链做模板重新合成一段做模板重新合成一段DNADNA取代损伤片段取代损伤片段损伤修复系统损伤修复系统2023/5/26China Parmaceutical University核酸内切酶核酸内切酶UreABCUreABC识识别损伤部位别损伤部位在损伤两侧作一切口，在损伤两侧作一切口，产生产生3 3羟基，羟基，polIpolI填填补缺口，连接酶封闭补缺口，连接酶封闭切除修复切除修复2023/5/26China Parmaceutical University三、复制后修复三、复制后修复1.1.大肠杆菌的重大肠杆菌的重组修复系统组修复系统先复制再修复先复制再修复复制复

31、制损伤损伤同源重组同源重组修复修复2023/5/26China Parmaceutical University2.SOS2.SOS修复修复该系统正常时无活性，只在该系统正常时无活性，只在DNADNA损伤时才诱导产生损伤时才诱导产生SOSSOS修修复酶系统。使校正系统放松复酶系统。使校正系统放松了对错误核苷酸的识别，是了对错误核苷酸的识别，是以降低复制的忠实性为代价以降低复制的忠实性为代价的差错倾向复制。的差错倾向复制。2023/5/26China Parmaceutical University四、四、DNA损伤修复系统与药物损伤修复系统与药物DNADNA修复缺陷与癌症、神经症状和免疫缺陷的

32、发病修复缺陷与癌症、神经症状和免疫缺陷的发病机理有关，与衰老亦有某种相关。机理有关，与衰老亦有某种相关。DNADNA损伤修复是细胞内最重要的修复方式，能修复损伤修复是细胞内最重要的修复方式，能修复外因导致的外因导致的DNADNA损伤。损伤。损伤损伤DNADNA是当前临床治疗肿瘤常用的离子辐射及绝是当前临床治疗肿瘤常用的离子辐射及绝大多数抗癌药物共同的基本分子机制。大多数抗癌药物共同的基本分子机制。而而DNADNA损伤能力增强又是引起肿瘤耐药的一个重要损伤能力增强又是引起肿瘤耐药的一个重要因素。因素。2023/5/26China Parmaceutical University DNADNA修复

33、能力异常激活和增强修复能力异常激活和增强,是导致肿瘤对是导致肿瘤对DNADNA损伤剂先天性或获得性耐药的重要分子基础损伤剂先天性或获得性耐药的重要分子基础.相反相反,修修复缺陷则使肿瘤对其高敏感。修复的遗传性缺陷也是复缺陷则使肿瘤对其高敏感。修复的遗传性缺陷也是多种遗传性疾病的分子基础多种遗传性疾病的分子基础,这些患者常常表现出极这些患者常常表现出极高的肿瘤易感性。所有这些构成了将干扰高的肿瘤易感性。所有这些构成了将干扰DNADNA修复作为修复作为一种抗肿瘤辅助治疗措施的基础。一种抗肿瘤辅助治疗措施的基础。目前已有约十种靶向不同修复分子的化合物目前已有约十种靶向不同修复分子的化合物,正正在进行不同阶段的临床试验在进行不同阶段的临床试验.2023/5/26China Parmaceutical University本章要求掌握本章要求掌握DNADNA复制复制lReplicon,replication folk,leading Replicon,replication folk,leading strand,lagging strandstrand,lagging strandlDNADNA复制的酶学复制的酶学l原核生物原核生物DNADNA复制的过程复制的过程 DNADNA损伤修复损伤修复lDNADNA损伤修复的方式有哪些损伤修复的方式有哪些?