乙肝血清标志物检测ppt课件.ppt

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1、乙肝血清学标志物检测及意义 山西医科大学第二医院检验科郭先锋1.要点n 简介n 抗原组成n 传染源n 传播途径n 病原学诊断n 血清学模式及临床意义End2.前 言n 病毒性肝炎在我国各类传染病中发病率最高n 乙型病毒性肝炎在我国危害极大n 我国乙型肝炎患者近3 千万n 病毒性肝炎，一般特指由嗜肝病毒感染所引起的肝炎。n HBV-属嗜肝DNA 病毒3.A病毒性肝炎Hepatitis Virus肠道传播肠道外传播F,TTV?其它ENANBNANBBDC病毒性肝炎-背景4.传染源粪便血液/血源性物质/体液血液/血源性物质/体液血液/血源性物质/体液粪便传播途径粪-口经皮肤/经粘膜经皮肤/经粘膜经皮

2、肤/经粘膜粪-口慢性感染 否 是 是 是 否病毒性肝炎类型A B C D E基因组类型 ssRNA dsDNA ssRNA ssRNA ssRNA5.Hepatitis B Virusn 乙型肝炎的病原体n 乙型病毒性肝炎1是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。本病广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种传染病。6.n 乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发 病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高趋势估计全球半数以上人口已被

3、HBV 感染过，5%的人口为HBV 慢性感染.n 中国：乙肝高发区，人群HBsAg 的检出率达9.8%7.电镜下Hepatitis B Virus8.乙型肝炎病毒HBVn 乙型肝炎病毒（HBV）为专一的嗜肝病毒，近年由于核酸分子杂交技术的进展，在肝外器官细胞也能检出HBV-DNA。通过北京乙肝肝病毒试验研究提供了在肝外细胞复制的证据。人HBV 也可能在肝外细胞内复制，有待深入研究。HBV 感染者血清经电镜检查有3 种病毒颗粒.n 1.大球形颗粒，完整的HBV 颗粒直径为42nm，又名Dane 颗粒，分为包膜与核心的两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原下面藏有

4、e 抗原。9.乙型肝炎病毒HBVn.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主要为表面抗原，不含核酸及成分，为不完整的n.管形颗粒，实际上是一串小球形颗粒聚合在一起的，也含有表面抗原10.1.HBV形态结构大球形颗粒（Dane 颗粒）小球形颗粒管形颗粒11.HBV virionThe infectious virion is called the DANE particle.12.Dane 颗粒（完整的病毒）形态HBsAgHBcAgHBV DNADNAP（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）13.Both comprised of HBsAg14.HBV nomenclaturen HBV:hepatitis

5、B virusn HBsAg:hepatitis B virus surface antigenn HBsAb:hepatitis B virus surface antibodyn HBcAg:hepatitis B virus core antigenn HBcAb:hepatitis B virus core antibodyn HBeAg:hepatitis B virus e antigenn HBeAb:hepatitis B virus e antibody15.抗原组成(一)-HBsAgn 位于病毒表面，是一种糖蛋白(曾用名：澳抗)n 出现时间：HBV感染后2 6 个月（潜伏期

6、）n HBsAg 有10 个亚型，各亚型间存在不完全的交叉免疫。近年用亚型单克隆抗体研究表明，d和y、w 和r 决定簇可以同时存在于同一病毒抗原颗粒上，形成adwr、aywr、adyw 和adyr 复合亚型。16.n 其机制为不同亚型病毒的双重感染；单一亚型病毒感染后，有的HBV-DNA 发生点突变。临床表现病情反复，肝脏损害较重，因而有的HBV 感染者血清中同时HBsAg 阳性、抗-HBs 阳性。4 种亚型(adr,adw,ayr,ayw)。刺激机体产生保护性抗体即抗-HBs.17.HBsAg 血清中HBsAg 阳性是HBV 感染的标志。本身具有抗原性，无传染性。但由于HBsAg 常与HBV

7、 同时存在，故认为是传染性标志之一。但须注意，HBV-DNA 可自X基因区终点起逆向与肝细胞发生整合，整合后的S 基因表达较强，不断产生HBsAg，整合的HBcAg 基因组被抑制，不表达HBeAg、HBcAg，在这种情况下，即使HBV已从体内清除，而HBsAg 仍可持续阳性，从理论上讲，这种HBsAg 阳性血液并无传染性。18.急性HBV 感染后，血清中首先出现HBsAg，整个急性期均可阳性，至恢复期可滴度下降或转阴。如HBsAg 持续阳性半年以上，称为慢性HBsAg 携带者（无症状HBsAg 携带者），可持续阳性达数年。一般认为HBsAg 滴度与病变程度不成比例。肝功能正常，HBsAg 滴度

8、高，肝脏可重要病变，若HBsAg 阴性及DNAp 阴性，表示无重要传染性。反之，肝功能异常，HBsAg 滴度不高，肝脏可有明显病变，如有部分肝硬化、肝癌患者呈HBsAg 阴性或低滴度。无症状HBsAg 携带者或慢性活动性乙型肝炎均可有相同的HBsAg 滴度变化不能代表病情的轻重，因此分解此不能将HBsAg 滴度的变化作为判断病情轻重和药物治疗效的指标。19.n 用免疫电镜及免疫荧光法在肝细胞浆内证实有HBsAg,而血清中HBsAg 阴性，其机制尚无确切解释。已知原因之一是现用的RIA 检测法，其测试灵敏度为10-5,尚不能测出最低感染量(10-7)，因此有10%假阴性，故对HBsAg 的判断，

9、以阳性有诊断意义，阴性不能排除HBV 感染。近年发现血清中HBV 标志均阴性，而在白细胞或肝细胞内检出HBV-DNA，说明确定或除外HBV 感染不能单凭HBsAg 是否阳性，应与其他标志结合判断。20.HBsAgn 持续时间 急性自限性肝炎：血中HbsAg 大多可持续1-6 周，最长可达6 个月内可消失 慢性肝炎或慢性HBsAg 携带者：可持续阳性。21.抗原组成(二)-HBcAgn HBcAg 为HBC 复制指标.位于Dane 颗粒核心部分和肝细胞核内，在血清中不易检出游离的HBcAgn 主要成分是蛋白质n 刺激机体产生抗-HBc(非保护性抗体)n 存在于受感染的肝细胞核内，有很强的免疫原性

10、，在乙肝急性期、恢复期和HBsAg 携带者中常可检出抗-HBc。除非HBV C 基因序列出现极少数变异或感染者有免疫缺陷。n 抗-HBc IgM 阳性提示急性期或慢性感染急性发作，抗HBc IgG 出现较迟，但可保持多年或者终生。22.（抗-HBs 出 现 时 间：急 性 感 染 后 期 或HBsAg 转 阴 后（数 月 才 能 检 测 出）.6-12 月 内 逐 步 上 升 至 高峰，可持续多年，但滴度会逐渐下降。抗-HBs为 保 护 性 抗 体（中 和 抗 体）其 出 现标志着HBV感染进入恢复期-HBs 对 相 同HBsAg亚 型 的HBV再 感 染 有 免 疫力，但对不同亚型的HBV保

11、护力不完全。23.抗原组成(三)-HBeAgn 位于HBV 的核心,是一种可溶性蛋白抗原n HBeAg 和Dane 颗 粒 出 现 相 平 行，且 与DNA 多 聚 酶 在 血 中 的消长动态相符合n 血 中HBeAg 的 出 现 可 作 为HBV 复 制 及 血 清 有 感 染 性 的 指 标.急 性HBV 感 染 时HBeAg 的 出 现 时 间 略 晚 于HBsAg，在 病 变极 期 后 消 失，如 果HbeAg 持 续 存 在 预 示 趋 向 慢 性。大 部 分情况持续存在表示患者处于高感染低应答期。n 刺 激 机 体 产 生 抗-HBe。转 换 过 程 意 味 着 由 免 疫 耐 受

12、 转 换 为免疫激活，此时常有病变活动的激化。n 抗-HBe 能 与 受 染 肝 细 胞 表 面 的e 抗 原 结 合,通 过 补 体 介 导 破坏 受 染 的 肝 细 胞,抗-HBe 的 出 现 是 预 后 良 好 的 征 象。抗HBe阳 转 后，病 毒 复 制 处 于 静 止 状 态，传 染 性 降 低。部 分 病 人仍有病毒复制，肝炎活动，称为HBeAg 阴性慢性肝炎。24.HBV DNA是病毒复制和有传染性最直接的证据检 测 方 法：斑 点 杂 交 法、PCR 法 近 年 用 多 聚 酶 链 反应（PCR）这 一 体 外DNA 扩 增 技 术，使 灵 敏 度 提 高100 倍 以 上（

13、10FGfg/ml），可 测 出 极 微 量 的 病 毒。HBV-DNA-p 是HBV 核 心 所 具 有 的DNA-p，在 病 毒 复 制过 程 中 起 逆 转 酶 作 用。DNA-p 活 性 是 表 示HBV 复 缺 点活 力 的 重 要 指 标。HBV-DNA 及DNA-p 检 测 有 助 于 判断HBV 感 染 者 病 毒 复 制 程 度 及 传 染 性 大 小，较 灵 敏评价抗病毒药物的疗效。乙 肝25.抗原组成(四)-Pre-S抗原n 位于HBV 的外衣壳上，有两种n 刺 激 机 体 产 生 抗Pre-S1和 抗Pre-S2，能 阻 断HBV 与 肝 细 胞 受 体 结 合，从 而

14、起到抵抗病毒的作用n 抗Pre-S1和 抗Pre-S2的 出 现，表 示 病情好转，趋向痊愈26.传染源n 患者n 潜伏期n 急性期n 慢性期n 无症状HBsAg 携带者27.高 中等 低/不能检出血液 精液 尿血清 阴道分泌物粪便伤口渗出物唾液汗液泪液乳汁各种体液中HBV 的浓度28.血源性传播 输血、注射、外科和牙科手术、针刺等 剃刀、牙刷和蚊虫叮咬等 母婴垂直传播 宫内传播 分娩时微小皮损处传播 产后母婴密切接触 性传播HBV 传播途径29.30.病原学诊断(一)-抗原抗体检测n 项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 以及抗-HBc IgMn 方法n ELIS

15、A(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性)n 发光免疫分析(定量)n 反相间接血凝试验(少用)31.ELISA 的基本原理n 利用抗原和抗体特异性结合n 主要的试剂n 固相抗原或抗体n 酶标记的抗原或抗体n 酶的底物32.ELISA 的主要方法n 间接法:测定抗-HBsn 夹心法：测定HBsAg 和HBeAgn 竞争法：测定抗-HBcn 中和法：测定抗-HBen 捕捉法：测定抗-HBc IgM33.病原学诊断(二)核酸检测n 核酸杂交n 探针n PCRn 引物34.各项HBV 血清标志物的解释n HBsAg HBV 感染的标志,可能是急性或慢性n A

16、nti-HBs 既往感染自然免疫/接种疫苗产生n Anti-HBc IgM 急性HBV 感染标志n Anti-HBc IgG 既往或慢性HBV 感染n HBeAg 病毒复制活跃，具有高度传染性n Anti-HBe 慢性感染,病毒不再复制,低传染性n HBV-DNA 直 接 测 定 病 毒 复 制 状 态，比HBeAg 更准确；临床主要用于监测治疗反应35.为什么要开展乙肝“两对半”定量检测n 乙型病毒性肝炎是世界性的传染病，严重地威胁着人类的健康。我国是乙型病毒性肝炎高发病国家。据统计全世界无症状携带者（HBsAg 携带者）超过2.8 亿，我国占1 亿以上，且多数无症状。所以乙肝的早期诊断对控

17、制传染源、降低发病率及疾病的治疗均具有很重要的意义。酶标（ELISA）检测始于20 世纪80 年代中期，它对乙肝“两对半”定性测定在疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用，但酶标检测HbsAg 灵敏度较低，不能真正意义上定量测定血清中HbsAg 含量。随着临床医学的发展，定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求。化学发光免疫分析定量测定乙肝“两对半”大大弥补了酶标定性测定及灵敏度低的不足。36.血清学检测的临床意义HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义 急性或慢性感染(大三阳)+-+-+乙肝后期或慢性感染(小三阳)-+-潜伏期或急性乙肝早期-+痊愈或恢复期

18、,有免疫力-+-痊愈,有免疫力疫苗接种或曾经感染过,有免疫力37.血清学检测的临床意义 HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义血清学检测的临床意义 血清学检测的临床意义 急性或慢性感染(传染性弱)+-+-+急性乙肝恢复期或既往感染-+急性窗口期或既往感染康复期-未感染过 HBV+-+-+急性感染趋向恢复;慢性携带者HBV感染已恢复,有免疫力38.SymptomsHBeAganti-HBeTotal anti-HBcIgM anti-HBcanti-HBsHBsAg0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100Acute HBV Infectio

19、n with RecoveryTypical Serologic CourseWeeks after ExposureTitre39.IgM anti-HBcTotal anti-HBcHBsAgAcute(6 months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52YearsWeeks after ExposureTitreProgression to Chronic HBV InfectionTypical Serologic Course小结40.乙肝五项检测的影响因素n 1.样本采集与处理的影响1.1 标本严溶血及混

20、有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。1.2 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD 值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA 系统中辣根过氧化物酶活性。1.3 标本凝固不全，正常血液采集后1/22h 开始凝固，1824h 血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，

21、使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。41.乙肝五项检测的影响因素n 2、试剂的影响2.1 乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%99.3%,7889%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。2.2 不

22、同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA 检测HBsAg 结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。42.乙肝五项检测的影响因素n 3、干扰物质的影响有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig 抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF 因子可与标记二抗的FC 段法结合造成假阳性，补体从C1q

23、 活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc 的C1q 分子结合点暴露出来，则补体C1q 可将二者连接起来造成假阳性，采用56 30 分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。43.乙肝五项检测的影响因素n 4、药物的影响4.1 高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的

24、检出；而且其所生产的生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg 阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5ML的盐酸处理标本1小时可提高出率。4.2 为预防乙肝，部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的12周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。44.乙肝DNA 检测的临床意义n HBV-DNA称为乙肝病毒脱氧核糖核酸。乙肝病毒是一种

25、部分双链DNA病毒，也就是说它的遗传物质是DNA，它载有病毒所有遗传信息，乙肝病毒靠它才可以复制、增殖、繁衍后代。研究证明，乙肝病毒的裸DNA(没有蛋白质包裹DNA)就有感染性，完成对宿主的侵袭，造成宿主体内出现完整的乙肝病毒颗粒。也就是说HBV-DNA相当于完整的乙肝病毒颗粒。因此，检测HBV-DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”。DNA的检测的目的主要是判断目前患者病毒复制程度的大小，也是传染性大小，尤其在判断乙肝的转归，以及用药前后的疗效的判断有很重要的作用，也是重要的用药指征之一，尤其是抗病毒治疗。现在这种基因的检测技术已经广泛的应用于临床。45.应采取以疫苗接种和切断传播途径为重

26、点的综合性措施。一.乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白（HBIG）的应用在目前HBsAg 携带者广泛存在，传染源管理十分困难的情况下，控制和预防乙型肝炎，关键性措施是用乙肝疫苗预防。我国已将乙肝疫苗接种纳入计划免疫，此外下列人群亦为乙肝疫苗接种的适应症：HBsAg 阳性，特别是HBeAg 同时阳性母亲所生的新生儿；乙肝高发区3 岁以下幼儿；医务人员，接触血液的人员；多次接受输血及血制品的患者；HBsAg阳性者家庭成员，尤其是配偶，凡是患有急性或慢性疾病或对福尔马林和抑菌剂硫柳汞过敏者禁用。预 防46.HBsAg 阳性孕妇的新生儿用30g 免疫3 针；HBsAg 阴性孕妇的新生儿第1 针为30g，第2、3

27、 针各为 10g；高危人群，如肾透析患者和其他职业性与乙肝密切接触者 用20g 免疫3 针；其他一般易感人群（包括儿童、成人）10g 免疫3 针。以 上均按0、1、6 月免疫程序，但新生儿第1 针应在出生后24 小时内接种，免疫效果更好。也有用0、1、2 月免疫程序者。目前多主张对高危人群（尤其HBsAg 阳性，同时HBcAg 阳性孕妇的新生儿；接种乙肝疫苗因人而异我国应用的免疫剂量和程序47.意外受HBV 感染，如被HBsAg 阳性血液污染的针头刺伤 或被HBsAg 阳性血液溅入眼结膜或口腔粘膜或输入HBsAg阳性血液、手术刀损伤皮肤等），一般应立即（24 小时之内）肌肉注射乙肝免疫球蛋白。如HBIG 每毫升含抗-HBs200IU 以上者可注射0.5 0.7ml/kg。48.49.欢迎指正50.