生化试验四垂直板聚丙烯酰胺凝胶连续电泳分离乳酸脱氢酶同工酶课件.ppt

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1、教学目的：教学目的：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶脱氢酶同工酶1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理；掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理；2.掌握聚丙烯酰胺凝胶分离乳酸脱氢酶的操作技术掌握聚丙烯酰胺凝胶分离乳酸脱氢酶的操作技术3.掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色。掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色。1.聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理；聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理；2.连续体系和不连续体系。连续体系和不连续体系。重点难点：重点难点：LOGOYour site here实验原理聚丙烯酰胺凝胶:是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(AcrAcr)和交联剂和交联剂N,N-N,N-

2、甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(BisBis)在催化剂在催化剂N N，N N，N N，N N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMEDTEMED)和过硫酸和过硫酸铵铵(APAP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)。APAP提供自由基，提供自由基，TEMEDTEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。应进行。电泳电泳 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，带电颗粒在电场的作用下，

3、向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。这种现象称之为电泳。3AP-TMTEDAP-TMTED催化体系催化体系 TEMED催化催化AP生成生成硫酸自由基硫酸自由基：S2O82 2SO4硫酸自由基的氧原子激活硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：单体并形成单体长链：Bis将单体长链间连成网状结构：将单体长链间连成网状结构：LOGOYour site here实验原理 O O OCH2=CHCNH2 +CH2=CHCNHCH2NHCCH=CH2(Acr)(Bis)（聚丙烯酰胺）（聚丙烯酰胺）6 凝胶的总质量浓度凝胶的总质量浓度T和交联度和交联度C决定凝胶的有效决定凝胶的有效孔

4、径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。得以分离。大多数蛋白质在大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为以这个浓度的凝胶称为标准胶标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。测试，而后确定适宜的凝胶浓度。7聚丙烯酰胺凝胶电泳的类

5、型聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 连续系统连续系统 是指电泳系统采用是指电泳系统采用相同孔径的凝胶相同孔径的凝胶、缓冲系统缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子的电荷效应电荷效应进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只进行分离，凝胶的分子筛效应不明显，一般只用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优用于分离一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制胶简单快捷，缓冲系统的点是制胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样恒定，可以防止样品进胶后因品进胶后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。单。8 不连续系

6、统不连续系统 是指使用是指使用不同孔径不同孔径的凝胶和的凝胶和不同缓不同缓冲体系冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶浓缩胶的堆积的堆积作用，可使样品在作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。续系统不可比拟的优越性，分辨率高

7、。不连续电泳的不连续电泳的四个不连续性四个不连续性 凝胶浓度凝胶浓度的不连续的不连续性；性；缓冲液离子成分缓冲液离子成分的不连续性；的不连续性；缓冲液缓冲液pH梯度的不梯度的不连续性；连续性；电位梯度电位梯度的不连续性的不连续性。10关于乳酸脱氢酶关于乳酸脱氢酶 1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四聚体。LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH同工酶各

8、组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据之一。11乳酸脱氢酶同工酶活性染色乳酸脱氢酶同工酶活性染色 用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：LOGOYour site here分离胶的制备置小烧杯中置小烧杯中,混匀混匀,迅速注入到二块玻璃板之间迅速注入到二块玻璃板之间(短玻璃短玻璃朝负极朝负极),),凝胶加至横板的凝胶加至横板的0.5cm0.5cm处；处

9、；在室温中聚合在室温中聚合20-3020-30分钟。分钟。注意：注意：acr/bisacr/bis有神经毒有神经毒/制胶时避免产生气泡制胶时避免产生气泡1号试剂（电泳缓冲液）号试剂（电泳缓冲液）2.5ml1次次2号试剂号试剂5.0ml1次次双蒸水双蒸水2.5ml1次次3号试剂号试剂（凝胶浓度（凝胶浓度7.5%，Ph8.9）10ml2次次151.晶状体晶状体 40L 2.脑脑 40L3.心脏心脏 40L 4.肝脏肝脏 40L 5.肾脏肾脏 40L6.卵巢卵巢 40L7.肌肉肌肉 40L 注意：加样前先倒入电泳缓冲液，没过短玻璃；上样时注意：加样前先倒入电泳缓冲液，没过短玻璃；上样时不要扎破加样孔

10、，也要避免样品溢出。不要扎破加样孔，也要避免样品溢出。LOGOYour site here分离胶的制备分离胶的制备浓缩胶的制备浓缩胶的制备 加样加样 待分离样品的准备待分离样品的准备 电泳电泳（电压（电压100-120v，电流，电流20mA）染色染色电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色液，染色30min；三三.实验报告的格式及要求：实验报告的格式及要求：1.原理（连续体系电泳分离，活性染色）原理（连续体系电泳分离，活性染色）2.操作（简练陈述实际操作）操作（简练陈述实际操作）3.结果（铅笔绘

11、图：正负极、条带数目、强弱、距离，某组织）结果（铅笔绘图：正负极、条带数目、强弱、距离，某组织）4.结果说明（同工酶的组织特异性）结果说明（同工酶的组织特异性）四四.思考题思考题 1.何谓连续体系？不连续体系？不连续体系的浓缩效应是何谓连续体系？不连续体系？不连续体系的浓缩效应是怎样实现的？怎样实现的？2.操作中有哪些关键环节？应做何处理？操作中有哪些关键环节？应做何处理？3.用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质和分离乳酸脱氢酶同工用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质和分离乳酸脱氢酶同工酶有哪些相同之处和不同之处？酶有哪些相同之处和不同之处？20其他注意事项其他注意事项爱惜电泳装置，轻拿轻放，避免产生划痕，损坏需赔偿！爱惜电泳装置，轻拿轻放，避免产生划痕，损坏需赔偿！染色液价格昂贵，按量发放（两块胶染色液价格昂贵，按量发放（两块胶30mL），随用随取，），随用随取，注意避光，如果没有变绿仍可继续使用，不影响染色效果！注意避光，如果没有变绿仍可继续使用，不影响染色效果！实验完成后，将电泳装置洗净，所用配件放回盘中，老师实验完成后，将电泳装置洗净，所用配件放回盘中，老师检查合格后方可离开！检查合格后方可离开！