分离以尿素为氮源的微生物及计数.ppt

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1、微生物种微生物种类类及其代及其代谢谢同化作用：同化作用：生物体从外界获取营养物质，转化为自身生物体从外界获取营养物质，转化为自身组成物质的过程。组成物质的过程。异化作用：异化作用：生物体自身物质分解，放出能量，排出废生物体自身物质分解，放出能量，排出废物的过程。物的过程。微生物种微生物种类类及其代及其代谢谢同化作用类型：同化作用类型：自养型：自养型：直接利用环境中的无机物合成自身直接利用环境中的无机物合成自身所需要的有机物。如进行光合作用的绿色植所需要的有机物。如进行光合作用的绿色植物、蓝细菌。物、蓝细菌。硝化细菌硝化细菌化能合成作用：利用化学反应化能合成作用：利用化学反应释放的化学能，将无机

2、物合成自身的有机物。释放的化学能，将无机物合成自身的有机物。异养型：异养型：直接利用环境中的有机物合成自身直接利用环境中的有机物合成自身所需要的有机物。如各种动物、大多数细菌所需要的有机物。如各种动物、大多数细菌等。等。微生物种微生物种类类及其代及其代谢谢异化作用类型：异化作用类型：有氧呼吸型（需氧型）有氧呼吸型（需氧型）C6H12O6+6O2+6H2O6CO2+12H2O+能量能量 无氧呼吸型（厌氧型）无氧呼吸型（厌氧型）C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量能量 C6H12O6 2C3H6O3+能量能量微生物种微生物种类类及其代及其代谢谢微生物包括哪些微生物包括哪些类类型？型？构成

3、微生物的构成微生物的细细胞胞类类型有哪些？型有哪些？不同微生物代不同微生物代谢类谢类型有哪些？型有哪些？同化作用同化作用+异化作用异化作用=代代谢类谢类型型微生物种微生物种类类及其代及其代谢谢微生物微生物的的类类型型细细胞胞类类型型代代谢类谢类型型举举例例细细菌菌单细胞、单细胞、原核细胞原核细胞自养需氧型自养需氧型异养需氧型异养需氧型异养厌氧型异养厌氧型蓝细菌、蓝细菌、硝化细菌硝化细菌醋酸杆菌、醋酸杆菌、大肠杆菌大肠杆菌乳酸菌、乳酸菌、大肠杆菌大肠杆菌微生物种微生物种类类及其代及其代谢谢微生物微生物的的类类型型细细胞胞类类型型代代谢类谢类型型举举例例真菌真菌单细胞、单细胞、真核细胞真核细胞多细

4、胞、多细胞、真核细胞真核细胞异养、异养、兼性厌氧兼性厌氧异养异养需氧型需氧型酵母菌酵母菌霉菌（青霉、霉菌（青霉、曲霉）曲霉）微生物种微生物种类类及其代及其代谢谢微生物微生物的的类类型型细细胞胞类类型型代代谢类谢类型型举举例例病毒病毒无无细细胞胞结结构，构，在在细细胞内寄胞内寄生生流感病毒、流感病毒、HIV、噬菌、噬菌体、植物病体、植物病毒等毒等微生物的代谢类型是配制培养基及培养的基础微生物的代谢类型是配制培养基及培养的基础分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数实验目的实验目的1 1使使用用专专一一的的培培养养基基（含含有有尿尿素素）分分离离专专一一的的细细菌菌（有（有脲脲

5、酶的细菌）酶的细菌）2 2使使用用指指示示剂剂颜颜色色的的变变化化检检知知酶酶（脲脲酶酶）所所催催化化的的反应反应3 3说明测定细菌数量的原理与方法说明测定细菌数量的原理与方法 分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数实验原理实验原理（1）琼脂和琼脂糖）琼脂和琼脂糖 琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖琼脂糖和和琼脂果胶琼脂果胶，还含有少量的，还含有少量的含氮含氮化合物，及其它有化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：不可缺少的组成成分

6、，其优点是：其主要成分不能被微生物利用；其主要成分不能被微生物利用；可使培养基可使培养基固化固化；不影响不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。培养基中其他营养物质被细菌吸收。分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数实验原理实验原理 实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以尿素为氮以防止琼脂中的含氮化合物被以尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。分离

7、以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数（2）酸碱指示剂（鉴定）酸碱指示剂（鉴定）尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在脲酶的催化下分解产生了脲酶的催化下分解产生了NH3，溶液会呈，溶液会呈碱碱性。性。本实验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培本实验中，酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是养基中，其变色范围是pH6.48.2，在酸性情况下，在酸性情况下呈呈黄黄色，碱性情况下呈色，碱性情况下呈红红色，色，实验原理实验原理 以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周

8、围扩散，将培养基中尿素的分解，产生产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生的的NH3使培养基的使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红由黄色变成红色，圆形红色区域愈大，表明基中的酚红由黄色变成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用这种菌利用尿素尿素的能力愈强。的能力愈强。分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数关键技术关键技术“涂布分离法涂布分离法”涂布分离时，需要先将涂布分离时，需要先将菌液稀释，一般稀释到菌液稀释，一般稀释到10-510-7之间，然后取之间，然

9、后取0.1mL的不同稀释度的菌液，放在培养皿的固体培养基上，再的不同稀释度的菌液，放在培养皿的固体培养基上，再用消毒后的玻璃刮刀把这些菌液涂布在培养基平面，在用消毒后的玻璃刮刀把这些菌液涂布在培养基平面，在适当的稀释度下，可培养产生相互分开单个的菌落。通适当的稀释度下，可培养产生相互分开单个的菌落。通常每个培养皿中有常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩大培养后，再做功能将每个菌落分别接种在斜面上扩大培养后，再做功能性实验。性实验。分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数基本操作步骤基本操作步骤（1）制制备备空空白白

10、平平板板：取取2个个三三角角瓶瓶，分分别别装装入入已已灭灭菌菌的的全全营营养养LB固固体体培培养养基基和和尿尿素素固固体体培培养养基基，放放在在超超净净工工作作台台上上，冷冷却却至至60 左左右右时时，在在酒酒精精灯灯旁旁把把上上述述两两种种培培养养基基分分别别倒倒至至2个个培培养养皿皿中中（做做两两组组，共共4个个空空白白平平板板），轻轻轻轻摇摇匀匀，平平放放至凝固。至凝固。分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数（2）制制备备细细菌菌悬悬液液：在在无无菌菌条条件件下下，在在将将1g土土样样加加到到装装有有99 mL无无菌菌水水的的三三角角瓶瓶中中，振振荡荡10min，即

11、即成成10-2土土壤壤稀稀释释液液，并并依依次次制制备备出出10-310-7稀稀释释液液。例例如如，若若想想制制备备10-6的的稀稀释释液液，可可取取0.5 mL 10-5的的稀稀释释液液。取取样样时时，尽尽量量只只取取悬悬液液，倒倒入入有有4.5 mL无无菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数（3）涂布法分离细菌涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取：在无菌条件下，分别取0.1 mL的稀释度为的稀释度为10-4和和10-5的土壤稀释液（细菌悬液）的土壤稀释液（细菌悬液），分别分别加到装有加到装有全

12、营养全营养LB培养基培养基和和尿素培养基尿素培养基的培养皿的培养皿（空白平板）中；再将保存在（空白平板）中；再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。菌悬液）均匀涂布到整个平面上。分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数（4）将培养皿倒置摆放在）将培养皿倒置摆放在37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h，观察菌落数观察菌落数。观察实验结果观察实验结果 计数：统

13、计培养基上菌落数计数：统计培养基上菌落数分离以尿素为氮源的微生物并计数分离以尿素为氮源的微生物并计数培养基上菌落数统计比较培养基上菌落数统计比较 1 与稀释度为与稀释度为10-5相比，培养基中的菌落数在相比，培养基中的菌落数在 稀释度为稀释度为10-4时时 2在相同的稀释度的情况下，尿素培养基中的在相同的稀释度的情况下，尿素培养基中的菌落数菌落数 于于LB培养基中的菌落数，其原因是培养基中的菌落数，其原因是 。多多少少讲练测讲练测P174微生物的培养微生物的培养微生物微生物计计数方法数方法 活菌活菌计计数数样样品稀品稀释释度足度足够够高高时时，培养基表面只生，培养基表面只生长长1个菌落（来源于

14、个菌落（来源于样样品稀品稀释释液中的液中的1个活菌）。根据个活菌）。根据平板上菌落数，推平板上菌落数，推测样测样品中大品中大约约含有多少活菌。含有多少活菌。结结果果一般用一般用菌落数菌落数而不是活菌数表示。而不是活菌数表示。显显微微观观察察计计数数红细红细胞胞计计数数板，板，观观察数量，再根据察数量，再根据浓浓度比例度比例计计算出菌体数量。算出菌体数量。微生物的培养微生物的培养血球（血细胞）计数板血球（血细胞）计数板计数室（中央大方格）计数室（中央大方格）的长、宽和高分别为：的长、宽和高分别为：1 mm、1 mm和和 0.1mm 计数室的容积：计数室的容积：0.1mm3（万分之一毫升）（万分之

15、一毫升）取样：取样：稀释一定倍数的稀释一定倍数的菌液菌液25格格X16格格16格格X25格格（100个小格）个小格）（80个小格）个小格）微生物的培养微生物的培养血细胞计数板的取样与计数方法血细胞计数板的取样与计数方法（一）（一）25 格格 16格格 酵母细胞数酵母细胞数/ml100小格内酵小格内酵母细胞个数母细胞个数/100400104稀稀释倍数释倍数 计数顺序：计数顺序：左上左上右上右上右下右下左下左下 压在格线的，只统计左线压在格线的，只统计左线和上线和上线微生物的培养微生物的培养（二）（二）16格格25格格酵母细胞数酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数/80400

16、104稀稀释倍数释倍数（07北京）发酵法生产酒精后的废液（北京）发酵法生产酒精后的废液（pH4.3）含有大量）含有大量有机物，可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲有机物，可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲料。培养、制取白地霉菌体的实验过程示意图如下。请料。培养、制取白地霉菌体的实验过程示意图如下。请据图分析回答问题：据图分析回答问题：（1）实验过程中培养白地霉的培养基是）实验过程中培养白地霉的培养基是_。培养基定量分装前，先调节培养基定量分装前，先调节_，分，分装后用棉塞封瓶口，最后装后用棉塞封瓶口，最后_处理。处理。（1 1）废液上清液）废液上清液 pH pH 灭菌灭菌（2）图中）图中过程称为过程称为_，从甲到丁，从甲到丁的培养过程是为了的培养过程是为了_。白地霉的。白地霉的代谢类型为代谢类型为_。（2 2）接种）接种 扩大培养扩大培养 异养需异养需氧型氧型（3）为确定菌体产量，图中）为确定菌体产量，图中操作之前，应先称量操作之前，应先称量_的质量。过滤后需反复烘干称量，直至的质量。过滤后需反复烘干称量，直至_。所得菌体干重等于。所得菌体干重等于_（3 3）滤纸）滤纸 恒重（质量基本不变）恒重（质量基本不变）恒重时的质恒重时的质量与滤纸质量之差（合理答案均给分）量与滤纸质量之差（合理答案均给分）讲练测讲练测P176 5