分子遗传学第三章--DNA的生物合成课件.ppt

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1、第三章第三章 DNA的生物合成的生物合成DNA DNA 复制一般特征复制一般特征参与参与DNADNA复制的酶类复制的酶类DNADNA复制基本过程复制基本过程DNADNA复制的调控复制的调控DNADNA损伤与修复损伤与修复第一节第一节 DNA复制的一般特征复制的一般特征一、一、DNA的生物学功能的生物学功能1、储存遗传信息、储存遗传信息2、复制遗传信息、复制遗传信息3、表达遗传信息、表达遗传信息4、遗传变异、遗传变异1962,Nobel PrizeWatson(Nature,1953):Watson(Nature,1953):我们假设的特异的（碱基）配对方式我们假设的特异的（碱基）配对方式我们假

2、设的特异的（碱基）配对方式我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。15NP0P1P2P3P4P0P2P0P414N 15N/14N 15NMeselson-Stahl experiment1958,PNAS2 DNA复制的半

3、不连续性复制的半不连续性复制时复制时DNA链延伸可能有三种方式：链延伸可能有三种方式：12 3 1967年，日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生年，日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生1001000bp的短片段的短片段没有从没有从3 5 延长延长DNA链的聚合酶链的聚合酶2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性一一条条链链连连续续合合成成，称称主主导导链链，Leading Leading Strand Strand 另另 一一 条条 链链 分分 段段 合合 成成，称称 随随 从从 链链Lagging StrandLagging Strand 。原原因因：DNADNA双双螺螺旋旋分分子子两

4、两条条链链方方向向相相反反，新新链链合成的方向只能合成的方向只能5 533一个方向合成。一个方向合成。概括：概括：半保留半保留半不连续性半不连续性双向性双向性一一 DNA聚合酶聚合酶(Polymerase)1956年，大肠杆菌年，大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 1959，Nobel Prize（一）（一）作用机制作用机制 以以DNA做模板，碱基互补配对，做模板，碱基互补配对，催化催化4种种dNTP之间形成磷酸二酯之间形成磷酸二酯键，从而延长键，从而延长DNA链。链。在在模板模板链上进行链上进行 不能从头合成，在不能从头合成，在引物引物的的3 3OHOH端上延端上延长长新链延长方向为新链延长方向为5

5、 533延长延长 （二）（二）原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶 有有3 3种：种：DNADNA聚合酶聚合酶 I I，IIII，IIIIII。多功能酶多功能酶：合成合成DNADNA的活性的活性 聚合酶作用聚合酶作用,延长延长DNADNA链。链。水解水解DNADNA的活性的活性 外切核酸酶活性外切核酸酶活性,切除不配对切除不配对碱基，起校读作用碱基，起校读作用35外切酶活性外切酶活性 从游离从游离3OH端切割端切割,识别和消除不配识别和消除不配对的核苷酸，保证了对的核苷酸，保证了DNA复制的忠实性。复制的忠实性。53外切酶活性外切酶活性 DNA聚合酶聚合酶I中的小亚基带有中的小亚基带有5外切酶外

6、切酶活性，从双链活性，从双链DNA的的5端降解释放出单端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸。核苷酸或寡聚核苷酸。35外切活性示意图外切活性示意图DNA聚合酶特有活性聚合酶特有活性2 DNA聚合酶聚合酶II不是复制酶，主要在不是复制酶，主要在DNADNA修复中起作用，无修复中起作用，无5 533外切酶活性。外切酶活性。5%DNA5%DNA聚合酶聚合酶I I的活性的活性3 DNA聚合酶聚合酶 III 1972 1972年发现年发现催化效率高，主要复制酶。由催化效率高，主要复制酶。由1010种种亚基组成亚基组成：（1 1）核心聚合酶：）核心聚合酶：5 53 3DNADNA聚合酶活聚合酶活性性 ：3 3-

7、5-5外切酶活性，外切酶活性，控制控制 复制忠实性复制忠实性 ：核心酶的组建：核心酶的组建 （2 2）二聚体：二聚体：构成滑动钳，将全酶固定在构成滑动钳，将全酶固定在DNADNA模板上，提高合成速率（模板上，提高合成速率（20/20/秒秒-750/-750/秒。秒。（3 3）复合物复合物 ：2 2 协助协助 二聚体结二聚体结合到合到 DNADNADNA聚合酶聚合酶 III形成不对称的二聚体，与形成不对称的二聚体，与DNADNA双链结合，后随双链结合，后随链折叠链折叠1801800 0，使后随链的物理方向，使后随链的物理方向与主导链与主导链一一致，同时催化两条链的复制。致，同时催化两条链的复制。

8、DNA 聚合酶聚合酶 pol pol pol 亚基数目亚基数目 1 7 105 3 聚合聚合酶酶活性活性 +3 5 外切酶活性外切酶活性 +5 3 外切酶活性外切酶活性 +-聚合速度聚合速度(核苷酸核苷酸/分分)1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力持续合成能力 3-200 1 500 500 000功能功能 切除引物切除引物,修复修复 修复修复 复制复制大肠杆菌大肠杆菌3种种DNA聚合酶性质比较聚合酶性质比较（三）（三）真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用DNADNA聚合酶聚合酶 :多亚基、多功能酶。多亚基、多功能酶

9、。大亚基：大亚基：DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。100nt/100nt/次次小亚基：引物酶活性，小亚基：引物酶活性，合成合成RNARNA。起始起始DNADNA的合成：合成的合成：合成RNARNA引物和在引物和在RNA3RNA3羟基端合成一段羟基端合成一段DNADNA。DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用DNADNA聚合酶聚合酶 的的结构结构多亚基组成：多亚基组成：P125 P125 大亚基，催化亚基，含聚合酶和大亚基，催化亚基，含聚合酶和 外切酶活性外切酶活性P50 P50 与增殖细胞核抗原与增殖细胞核抗原(PCNA)(PCNA)结合相关结合相关P66P66P12P12DNA聚合酶聚合

10、酶 的的功能功能主要主要DNADNA复制酶：复制酶：DNADNA聚合酶活性，延伸聚合酶活性，延伸DNADNA链。链。与与RFCRFC和和PCNAPCNA形成形成“全酶全酶”，在，在RFCRFC和和PCNAPCNA等的协同下，促使等的协同下，促使DNADNA聚合酶聚合酶 的解离的解离，DNADNA聚聚合酶合酶 接替接替DNADNA聚合酶聚合酶 继续继续DNADNA链的合成链的合成-DNADNA聚合酶聚合酶 向向DNADNA聚合酶聚合酶 的转换。的转换。复制校正功能：复制校正功能：3 3-5-5外切核酸酶活性外切核酸酶活性DNADNA聚合酶聚合酶 、主要功能：主要功能：DNADNA修复。修复。DN

11、ADNA聚合酶聚合酶：线粒体：线粒体DNADNA复制复制 二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白 1 1、PCNA：增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Proliferating Cell Nuclear Antigen)Antigen)，DNADNA聚合酶的附属蛋白，参聚合酶的附属蛋白，参与与DNADNA的合成，类似的合成，类似 二聚体。二聚体。2 2、RFC：复制因子：复制因子C(Replication C(Replication Factor C)Factor C)。多亚基复合物，。多亚基复合物，DNADNA聚合酶聚合酶的附属蛋白，的附属蛋白，识

12、别引物末端识别引物末端,参与链的延参与链的延长。类似长。类似 复合物。复合物。3、PRP1和和PRP2 Primer Recognition Protein 增加增加DNA聚合酶聚合酶 与模板引物末端的亲和力，与模板引物末端的亲和力，增加增加DNA聚合酶聚合酶 的活性。的活性。PCR 与Taq DNA 聚合酶Taq DNA聚合酶特性聚合酶特性（Taq DNA polymerase）最初由最初由H.A.ErlicH从热泉中的细菌中出来从热泉中的细菌中出来 性质性质具有具有53聚合酶活性以及依赖于聚合作用的聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性外切酶活性 耐热性耐热性此酶是一种耐热的依赖于此酶是

13、一种耐热的依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶最适反应温度为最适反应温度为7280 应用应用能以高温变性的靶能以高温变性的靶DNA分离出来的单链分离出来的单链DNA为模板，进行为模板，进行DNA的体外扩增的体外扩增PCR反应。反应。三 引物酶 primase DNA聚合酶不能引发聚合酶不能引发DNA新生链的合成，只能新生链的合成，只能在在已存在的已存在的DNA链链或或RNA链上延长链上延长DNA。引引物酶催化引物物酶催化引物RNA的合成。的合成。四 连接酶 ligase 19671967年发现年发现催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段必须都与完整的模板

14、链结合。必须都与完整的模板链结合。大肠杆菌的连接酶需大肠杆菌的连接酶需NAD+NAD+，真核细胞的连接酶真核细胞的连接酶需要需要ATPATP。可可连连接接双双链链DNADNA中中的的单单链链切切口口，RNA-DNARNA-DNA杂杂交交体体双双链链单单链链切切口口，不不能能连连接接双双链链RNARNA中中的的单单链链切切口。口。五 与DNA解链和解旋有关的酶五 与DNA解链和解旋有关的酶（一）（一）DNADNA螺旋酶（螺旋酶（HelicaseHelicase）催化双螺旋解旋和解链催化双螺旋解旋和解链需消耗需消耗ATPATP（二）拓扑异构酶（二）拓扑异构酶（Topoisomerase)Topoi

15、somerase)DNA DNA 回旋酶（回旋酶（GyraseGyrase）促进促进DNADNA双链的解开双链的解开,需消耗需消耗ATPATP。兼有内切酶和连接酶活性兼有内切酶和连接酶活性,可迅速使可迅速使DNADNA两条链断开又接上两条链断开又接上,消除解链酶产生的消除解链酶产生的拓扑张力。拓扑张力。当引入负超螺旋当引入负超螺旋时需要由时需要由ATPATP提供能量提供能量,同复制有关。同复制有关。（三）单链结合蛋白（三）单链结合蛋白DNA单链结合蛋白（单链结合蛋白（Single Strand Binding protein，SSB）复制因子复制因子A主要功能：主要功能：与单链亲和力大，稳定单

16、与单链亲和力大，稳定单链结构，保护单链免受核酸酶水解和链结构，保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成，有利复制进行。阻止双链形成，有利复制进行。第二节第二节 DNA 复制的基本过程复制的基本过程复制子复制子 RepliconRepliconReplicon Replicon 基因组中能独立进行复制的基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子结构单位称复制子,或者说单个复制起或者说单个复制起始点控制的始点控制的DNA,DNA,包含从起始位点到终止包含从起始位点到终止位点的全部位点的全部DNADNA。复制的起始位点复制的起始位点 控制并起始复制的控制并起始复制的特定位点。特定位点。终止位点终止位点 终

17、止复制的位点终止复制的位点每个细胞周期启动复制一次。每个细胞周期启动复制一次。复制在复制在特定部位特定部位起始。起始。原核生物仅有原核生物仅有一个一个起始部位。起始部位。真核生物有真核生物有多个多个起始部位。起始部位。半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。250Mb的的1号染色体，需要旋转号染色体，需要旋转250万次。万次。DNA拓扑异构酶解决了解开拓扑异构酶解决了解开DNA双螺双螺旋的问题旋的问题一一 复制的起始复制的起始（一）起始部位起始部位的序列特征的序列特征 同位素标记显示复制起始在特定部位开始同位素标记显示复制起始在特定部位开始 复制起始点复制起

18、始点:origin,ori:origin,ori DNA复制过程：复制过程：1 1、M M1313噬菌体的起始部位顺序特征噬菌体的起始部位顺序特征 5959bpbp的发夹结构的发夹结构 2 2、大肠杆菌大肠杆菌(OriC)(OriC)的起始部位顺序特征的起始部位顺序特征 240bp240bp的唯一起始部位的唯一起始部位 2 2个区域：个区域：起始蛋白识别结合区起始蛋白识别结合区：4 4个个9 9bpbp重复顺序重复顺序 邻近的邻近的ATAT富含区富含区3 3个个1313bpbp重复顺序重复顺序。大肠杆菌基因组复制起始部位大肠杆菌基因组复制起始部位3 3 3 3、酿酒酵母、酿酒酵母、酿酒酵母、酿

19、酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征起始部位顺序特征起始部位顺序特征A:含含ARS一致序列（一致序列（ACS），复制起始识别复合物结合），复制起始识别复合物结合B：增加复制起始位点的效率：增加复制起始位点的效率100200bp4 4 4 4、SV40SV40SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒猴空泡病毒猴空

20、泡病毒5211 5220 5230 5240 1 10 20 30CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTAGTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT 反转重复序列反转重复序列 大大T抗原结合部位抗原结合部位 II A/T 富含区富含区 图图3-7 SV40 复制起始部位结构复制起始部位结构复制起始位点特征：独特重复序列独特重复序列起始结合蛋白识别起始结合蛋白识别ATAT富含序列，有利于富含序列，有利于DNADN

21、A双链解旋双链解旋5 5 5 5、起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）（高等真核生物）（高等真核生物）多个复制起始点，有人发现任何大于多个复制起始点，有人发现任何大于15kb15kb的的DNADNA就能自主复制。就能自主复制。起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序列。列。特征：结合复制相关蛋白特征：结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异不同细胞复制起始位点的应用存在差异 （二）（二）起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与

22、1 噬菌体噬菌体（X174X174）priA priA 识别起始位点，识别起始位点，ATPATP酶活性酶活性priB priB 起始引发起始引发priC priC 起始引发起始引发DnaT DnaT 起始引发起始引发DnaB DnaB 起始引发起始引发DnaC DnaC 起始引发起始引发,与与DnaBDnaB一起作用一起作用DnaG DnaG RNARNA引物合成引物合成 2 2 大肠杆菌大肠杆菌 DnaA DnaA 识识别别并并结结合合于于oriCoriC区区，有有ATPATP酶酶活活性性，使使ATAT富含区富含区解解链，促进链，促进DnaBDnaB结合形成起始复合物。结合形成起始复合物。D

23、naB DNADnaB DNA螺旋酶，有解旋和解链作用。螺旋酶，有解旋和解链作用。DnaC DnaC 运输运输DnaBDnaB，形成起始复合物。形成起始复合物。DnaG DNADnaG DNA复制引发酶，合成引物。复制引发酶，合成引物。Hu Hu 促进复制复合物的形成。促进复制复合物的形成。回旋酶回旋酶 松弛正超螺旋，促进单链松弛正超螺旋，促进单链DNADNA产生。产生。单链结合蛋白单链结合蛋白 促进促进DNADNA解链，稳定单链解链，稳定单链DNADNA。3 3 3 3、真核细胞（真核细胞（真核细胞（真核细胞（SV40SV40）真核细胞（真核细胞（SV40）的）的DNA复制至少需要复制至少需

24、要6个蛋白因子参与。个蛋白因子参与。T抗原抗原：N N端为端为DNADNA结合区，识别起始位点，结合区，识别起始位点，C C端具有螺旋端具有螺旋 酶活性，在酶活性，在RFARFA的协助下解开双链。的协助下解开双链。SV40 SV40 编码编码RFA：人单链结合蛋白：人单链结合蛋白拓补异构酶拓补异构酶I或或II：解开超螺旋。：解开超螺旋。复制因子复制因子C（replication facter C,RFC）：形成起始复合物）：形成起始复合物DNA聚合酶聚合酶-引物酶复合物：合成引物，起始引物酶复合物：合成引物，起始DNADNA合成。合成。4 4、真核细胞（真核细胞（真核细胞（真核细胞（Yeast

25、Yeast）（1）ORC（Origin Recognition Complex）6个亚基组成个亚基组成 在真核生物中相当保守在真核生物中相当保守特异识别特异识别ARS（Autonomously replicating sequence）ORC1p，ORC2p，ORC4p 与与A 元件结合，元件结合，ORC5p与与B元件结合元件结合结合过程需要结合过程需要ATP（三）复制的起始引发（三）复制的起始引发（Priming）合成合成RNA引物的过程引物的过程 单链结合蛋白单链结合蛋白SSB与与M13噬菌体单链噬菌体单链DNA结合，在发夹结构前结合，在发夹结构前6 bp处，处，RNA聚合酶合成聚合酶合成

26、 2030个碱基的个碱基的RNA.破坏发夹结构；破坏发夹结构；SSB结合；结合；DNA聚合酶聚合酶III在在3OH延长延长DNA链。链。DNA聚合酶聚合酶I水解水解RNA，并并补补平缺口，连接酶连接平缺口，连接酶连接。1、M13噬菌体噬菌体priA,priB,priC识别起始点识别起始点在在DnaT帮助下帮助下DnaB,DnaC复合物结复合物结合形成前引发体合形成前引发体引发体引发体引发体可沿着引发体可沿着DNA链移动，在链移动，在合适的位点起始合适的位点起始引物引物RNA的合成的合成引发体的装配只能在起始点，引发体的装配只能在起始点，引物合成可在多处。引物合成可在多处。引发体移动的方向与引发

27、体移动的方向与DNADNA链链延长的方向相反。延长的方向相反。类似冈崎片段的合成类似冈崎片段的合成2、X174DNAPAS：primosome assembly site 3、大肠杆菌大肠杆菌Hu因子促进复合物形成因子促进复合物形成DnaA结合结合OriC富含富含AT区解链区解链2DnaB-DnaC复合物复合物DnaB解链解链4 SV404 SV40T抗原识别起始点和解链抗原识别起始点和解链RFA结合到单链结合到单链DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体拓扑异构酶参与下形成前引发体DNApol -引物酶结合形成引发体引物酶结合形成引发体SV40 DNA复制的起始复制的起始ORC：Origin Re

28、cognition Complex5、真核生物复制的起始、真核生物复制的起始“Licensing mechanisms”S期期 DNA合成合成MCM：微染色体支持蛋白：微染色体支持蛋白二二 DNADNA链的延长链的延长（一）（一）原核生物原核生物DNADNA链的延伸链的延伸延伸延伸反应反应：在在RNARNA引物的引物的OHOH端由端由DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII，按碱基互补按碱基互补规则延伸。规则延伸。前导链的延长前导链的延长：3 355方向这条链做模板链方向这条链做模板链的新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合的新链合成可以随着复制叉向前移动，连续合成（成（5 5 3 3）。随从链的

29、延长随从链的延长5 5 3 3 方向这条链做模板链的新链合成则方向这条链做模板链的新链合成则不能随着复制叉向前移动不能随着复制叉向前移动进行进行连续合成，只能连续合成，只能分段合成一小段，这一小段新合成的分段合成一小段，这一小段新合成的DNADNA链称链称冈奇片段。每一段新合成的一小段中冈奇片段。每一段新合成的一小段中有有RNARNA，由由RNARNA酶水解，酶水解，DNADNA聚合酶聚合酶I I补平，补平，最后由连接最后由连接酶酶连接。连接。DNADNA链延长的要点链延长的要点1 1)DNA)DNA聚合酶不能从头合成新链，只能在聚合酶不能从头合成新链，只能在3 3-OHOH羟基端延长。复制羟

30、基端延长。复制起始起始时的时的3 3-OHOH羟基端是羟基端是RNARNA。2)2)按照碱基互补原则合成新链。按照碱基互补原则合成新链。3)3)两条链同时复制，新链的延伸方向是两条链同时复制，新链的延伸方向是5 533，一条链连续合成，称主导链，另一条链不连，一条链连续合成，称主导链，另一条链不连续合成，称随从链（后随链）。续合成，称随从链（后随链）。4)复制以双向进行，复制正在进行的复制以双向进行，复制正在进行的部位称复制叉（部位称复制叉（Replication forkReplication fork）,复制叉从起始点沿着复制叉从起始点沿着DNADNA移动。移动。（二）（二）（二）（二）S

31、V40SV40SV40SV40的的的的DNADNADNADNA延伸延伸延伸延伸1、前导链的延伸前导链的延伸 PolPol 合成一段新链合成一段新链 在在RFCRFC和和PCNAPCNA协助下，协助下，PolPol PolPol 转换转换 由由Pol Pol 完成全部前导链的合成完成全部前导链的合成2 2、后随链的延伸、后随链的延伸复制的基本模式复制的基本模式型：细菌滚环式滚环式 X174D型型 线粒体线粒体DNAA protein:Phage 编码编码滚环可形成多联体滚环可形成多联体线粒体DNA复制裸露闭环双链状裸露闭环双链状 D型复制型复制H链：富含链：富含GL链：富含链：富含CDNA聚合酶

32、聚合酶三三 复制的终止复制的终止对于对于线性线性DNA复制例如复制例如 噬菌体等比较简噬菌体等比较简单，复制到单，复制到分子末端终止。分子末端终止。对于对于环状环状的大肠杆菌的大肠杆菌DNA复制和真核生复制和真核生物的物的DNA复制就比较复杂。复制就比较复杂。复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子复制叉到达终止区，完成复制前，复制暂停。两个子代代DNA缠绕在一起，需要分开。缠绕在一起，需要分开。大肠杆菌：大肠杆菌：有复制起始点，也有复制终止点。有复制起始点，也有复制终止点。细菌复制终止区含有多个约细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子的终止子(terminator)位点，位点，E.c

33、oli 有有7个终止子位点。个终止子位点。Tus:Terminus utilization substance 线性线性DNA在复制完成后，其末端由于引物在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短，需要在的水解而可能出现缩短，需要在端粒酶端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。）的催化下，进行延长反应。5 3 3 5 5 3 3 5 端粒端粒DNA：2009 诺贝尔生理/医学奖端粒酶(telomerase)依赖RNA的DNA聚合酶,其实质是一种逆转录酶。能识别特定的端粒重复序列,以自身RNA的部分序列(5-CUAACCCUAAC-3)为模板,合成新的端粒重复序列,使端

34、粒延长，保持染色体的完整 不需要DNA 模板 已知的恶性肿瘤特异性最强的标志，永生细胞 生殖细胞，造血干细胞，ips等非肿瘤细胞 端粒的缩短与衰老端粒酶以自身的RNA为模板，在3端合成DNA序列:RNA引物引物端粒酶的爬行模型端粒酶的爬行模型逆向转录逆向转录(Reverse Transcription)Reverse Transcription)上上世纪之初发现肿瘤世纪之初发现肿瘤RNARNA病毒病毒。6464年，年，TeminTemin报道了抑制报道了抑制DNADNA合成的放线菌素合成的放线菌素D D能抑制鸡肉瘤能抑制鸡肉瘤RNARNA病毒的繁殖病毒的繁殖。据此提出鸡肉瘤据此提出鸡肉瘤RNA

35、RNA病毒的繁殖须经过形成病毒的繁殖须经过形成DNADNA的阶段。的阶段。v7 70 0年年Temin Temin 和和Baltimore Baltimore 两个实验室同时两个实验室同时从从(鸡鸡)劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNARNA病毒中病毒中发现，在逆转录病毒病毒颗粒中存发现，在逆转录病毒病毒颗粒中存在着一种以在着一种以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA的酶，称为的酶，称为RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶。聚合酶。遗传信息从遗传信息从RNARNA流向流向DNADNA，即以即以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA称

36、为逆向转录，因此催化这一反应的酶又称为逆向转录，因此催化这一反应的酶又称称逆转录酶逆转录酶。逆向转录酶逆向转录酶由逆转录病毒基因组中由逆转录病毒基因组中polpol基因编码。是一种基因编码。是一种多功能酶多功能酶。有以有以RNARNA为模板和以为模板和以DNADNA为模板合成为模板合成DNADNA的的DNADNA聚聚合酶活性合酶活性。需要需要RNARNA或或DNADNA做引物；做引物；有有核糖核酸酶核糖核酸酶H H的活性（在逆转录酶的的活性（在逆转录酶的C C端），端），能从能从3 355和从和从5 533水解水解RNARNA，使使RNARNA与与DNADNA的杂交体分离。的杂交体分离。逆向转

37、录过程逆向转录过程 三三 逆向转录酶的生物学意义逆向转录酶的生物学意义1 1 用于合成用于合成cDNA.cDNA.建立建立cDNAcDNA文库文库(cDNA cDNA Library)Library)，获得基因或探针。获得基因或探针。2 2 与与PCRPCR连用连用 RT-PCRRT-PCR互补互补DNA（complementary DNA,cDNA）第四节第四节 DNA复制的调控复制的调控DNA复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，复制是细胞增殖的一个关键事件，因此，DNA复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。复制与细胞分裂是互相协调、互相调控的。无论原核还是真核细胞中无论原核还是真核细胞中D

38、NA复制都只发生在细复制都只发生在细胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，胞周期中特定时期，在一个细胞周期中，DNA必必须也只能须也只能复制一次复制一次。一一一一 大肠杆菌复制的调节大肠杆菌复制的调节大肠杆菌复制的调节大肠杆菌复制的调节1、起始体起始体 （orisomeorisome，起始复合物，蛋白质，起始复合物，蛋白质-ori Cori C复合物）的装配复合物）的装配 参与形成参与形成orisomeorisome的组分：的组分：Dna A,Hu,IHF，Fis，Dpi，Ici A，Cnu，Hha，Rob，Seq A，Arc A相互作用相互作用：Fis,IHF 调节调节 DnaA-ATP与与o

39、riC oriC 的结合，的结合，HUHU调节调节DnaA,IHF DnaA,IHF 结合到结合到oriC,oriC,并增强并增强DnaADnaA解链能力。解链能力。2 2、防止复制再次起始、防止复制再次起始(1)Dna A(1)Dna A活性的抑制活性的抑制 Dna A-ADP Dna A-ATPDna A-ADP Dna A-ATP无活性无活性 RIDA RIDA 有活性有活性 RIDA：regulatory inactivation of DnaA ori C(2)降低游离形式的降低游离形式的Dna A水平水平Dna A结合位点结合位点 dat A区区在复制后极短时间内降低在复制后极短时

40、间内降低 Dna A 水平水平可以结合可以结合300分子的分子的Dna A(3)(3)隔离隔离 ori Cori C ori CGATCCTAG甲基化甲基化未甲基化未甲基化摸板链摸板链新合成链新合成链Seq A 特异识别特异识别,并结合于半甲基化并结合于半甲基化ori C 的的GATC序列序列,使使ori C被隔离被隔离,防止复制再次发生防止复制再次发生二二 真核生物复制起始调控真核生物复制起始调控1 1、DNADNA复制起始的调控复制起始的调控2 2、细胞周期监控点机制、细胞周期监控点机制主要调控复制的起始(一一)、DNADNA复制起始的调节复制起始的调节1 1、复制起始点的选择复制起始点的

41、选择 复制起始点数量的调控复制起始点数量的调控 真核细胞有多个复制起始点，起用多少起真核细胞有多个复制起始点，起用多少起始点决定于始点决定于S S期的长短。期的长短。S S期短，起始点多。期短，起始点多。S S期长，起始点少。期长，起始点少。遗传性起始点：遗传性起始点：DNADNA上的起始元件上的起始元件 功能性起始点：功能性起始点：实际起始点实际起始点 遗传性起始点多于功能性起始点遗传性起始点多于功能性起始点酵酵 母母：自自 主主 复复 制制 序序 列列（autonomously autonomously replicating sequeences,ARS)replicating sequ

42、eences,ARS)酵母细胞酵母细胞3 3号染色体上有号染色体上有1414个遗传性复制起始个遗传性复制起始点，只有点，只有6 6个功能性复制起始点。个功能性复制起始点。将将Ura4Ura4基因处的强复制起始点突变后，在其附基因处的强复制起始点突变后，在其附近的弱复制起始点就成为强复制起始点。近的弱复制起始点就成为强复制起始点。Ura4Ura4：乳清苷酸脱羧酶乳清苷酸脱羧酶 高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点高等真核生物细胞至今未发现遗传性复制起始点的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。的序列特征，

43、但确实存在功能性的复制起始点。的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。的序列特征，但确实存在功能性的复制起始点。CHOCHO细胞核细胞核 蟾蜍卵细胞抽提物蟾蜍卵细胞抽提物 损坏损坏CHOCHO细胞核或细胞核或 裸露裸露DNADNA 非随机起始，同正常非随机起始，同正常 随机起始随机起始CHOCHO细胞细胞 复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关复制起始点的选择与细胞核或染色体结构密切相关2 2、复制起始调控机制复制起始调控机制（1 1）复制的允许机制（）复制的允许机制（Licensing modelLicensing model）（2）蛋白激酶的调控）蛋白激酶的调控 （1 1 1 1）

44、复制的允许机制（复制的允许机制（复制的允许机制（复制的允许机制（Licensing modelLicensing modelLicensing modelLicensing model）一个细胞周期中一个细胞周期中一个细胞周期中一个细胞周期中DNADNADNADNA复制发生一次且只能发生一次复制发生一次且只能发生一次复制发生一次且只能发生一次复制发生一次且只能发生一次 蟾蜍卵细胞蟾蜍卵细胞 Licensing controlLicensing control 复制复制外源细胞核外源细胞核复制后，复制后，Licensing Factor失活，失活的失活，失活的Licensing Factor不能

45、再次启动复制。核不能再次启动复制。核膜破裂后（细胞分裂后），新的膜破裂后（细胞分裂后），新的Licensing Factor进入核，启动下一周期进入核，启动下一周期的的DNA复制。复制。（2 2）蛋白激酶的调控蛋白激酶的调控蛋白激酶的调控蛋白激酶的调控真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶：真核细胞复制起始绝对必须的蛋白激酶：CDK 和和 Cdc7-Dbf4激酶激酶(1)、前复制起始复合物前复制起始复合物的形成的形成 组成成分：组成成分：ORC(Origin Recognition Complex)含含6种种蛋白质，蛋白质，Cdc6，RLF（Replication Licensing Factor

46、,复复制允许因子）。制允许因子）。(2)、CDK激活激活前前复制起始复合物复制起始复合物 复制前复合物复制前复合物受蛋白激酶的调控，或变成受蛋白激酶的调控，或变成起始复合物起始复合物，起始复制，或在复制过程中转变成起始复制，或在复制过程中转变成复制后复合物复制后复合物，就，就再也不能启动复制。再也不能启动复制。CDK（CyclinDependent),Cdc7-Dbf4激酶，激酶，蛋白激酶蛋白激酶A，蛋白磷酸蛋白磷酸酶酶2A，都参与复制的起始，在不同阶段起作用。都参与复制的起始，在不同阶段起作用。前复制起始复合物前复制起始复合物（pre-replicative complexpre-repli

47、cative complex，pre-RC)pre-RC)（在遗传性复制起始点装配）（在遗传性复制起始点装配）CDKCDK起始复合物（起始复合物（Replicative Complex,RC)Replicative Complex,RC)（在功能性复制起始点形成）（在功能性复制起始点形成）在在G1G1期向期向S S期过渡期间，期过渡期间，CDKCDK活性很高。活性很高。（二）（二）（二）（二）复制检查点机制复制检查点机制复制检查点机制复制检查点机制 识别识别DNADNA损伤或损伤或DNADNA复制阻断，通过复杂复制阻断，通过复杂的信号转导途径，阻断细胞周期，启动修复机的信号转导途径，阻断细胞周

48、期，启动修复机制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞制，恢复基因组的完整性，修复后再进入细胞周期。周期。在长期进化过程在长期进化过程中，细胞形成一中，细胞形成一套保证细胞周期套保证细胞周期中中DNA复制和染复制和染色体分配质量的色体分配质量的检查机制，即细检查机制，即细胞周期检查点胞周期检查点检查点：检查点：(1)G1 S S期检查点期检查点查看查看DNADNA有无损伤有无损伤 DNA damage checkpointDNA damage checkpoint 细胞周期暂时减慢或停止。细胞周期暂时减慢或停止。查看查看DNADNA复制的进度复制的进度 DNA replication DNA

49、replication checkpointcheckpoint 限制限制DNADNA复制速度复制速度(2)G2 M 管理染色体的正确分配管理染色体的正确分配 Spindle Spindle assembly checkpointassembly checkpoint第五节 DNA损伤与修复DNA 损伤类型和产生原因1.点突变 DNA聚合酶复制错误产生碱基自发的突变：碱基自发的突变：2.缺失或插入 核苷酸的缺失或插入 碱基的缺失3.化学修饰 氧化，甲基化，烷化4.DNA分子交联 顺铂，顺铂，丝裂酶素丝裂酶素5.DNA分子断裂DNA单链断裂DNA双链断裂：射线，重金属，病毒整合，DNA重排DNA

50、损伤的修复1.核苷酸修复 dGTP氧化产生8氧代dGTP 8oxodG 8氧代dGTP三磷酸脂酶 水解 该酶突变：A：TC：G突变高10010000倍2.直接修复O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）光修复光修复3.碱基切除修复DNA转葡糖基酶转葡糖基酶 4.核苷酸切除修复5.错配修复6.DNA链断裂的修复非同源末端连接 non-homologous end-joining同源重组修复同源重组修复 homologous recombination7.大肠杆菌SOS修复Lex A，Rec A修复完成后，修复完成后，DinI蛋白抑制蛋白抑制RecA作用作用（1）G1期期checkpoint，确