最新课件单克隆抗体学习教案.pptx

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1、会计学 1最新课件单克隆抗体(kngt)第一页，共64页。杂交瘤技术的诞生 1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国自然杂志上发表了题为“分泌具有(jyu)预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）1984年度荣获诺贝尔生理学和医学奖第1页/共64页第二页，共64页。一、杂交瘤技术(jsh)的基本原理 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化

2、增殖的杂交瘤 细胞系 单克隆抗体生成：接种(jizhng)杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体第2页/共64页第三页，共64页。抗体(kngt)种类：第一代抗体(kngt)多克隆抗体(kngt)（polyclonal antibody)第二代抗体(kngt)单克隆抗体(kngt)（monoclonal antibody)第三代抗体(kngt)基因工程抗体(kngt)（genetic engineering antibody)第3页/共64页第四页，共64页。B淋巴细胞:寿命短,分泌特异(ty)系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单 隆抗体第4页/共64页第五页，共6

3、4页。流程第5页/共64页第六页，共64页。不产生(chnshng)Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞(xbo)小鼠骨髓瘤细胞(xbo)系均来源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤细胞(xbo)都来源于LOU/c大鼠建立的骨髓瘤细胞(xbo)系:SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653 NSO/1第6页/共64页第七页，共64页。动 物：BALB/c小鼠48周龄(zhu ln)20g25g体重（二）免疫(miny)脾细胞第7页/共64页第八页，共64页。细胞性抗原：（12）107/只，不加佐剂，23周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+10

4、0微克抗原，36周100200微克抗原，融合(rngh)前3天，加强免疫体内免疫法-免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了免疫(miny)小鼠第8页/共64页第九页，共64页。淋巴细胞第9页/共64页第十页，共64页。浆细胞第10页/共64页第十一页，共64页。抗原(kngyun)接种第11页/共64页第十二页，共64页。免疫原特性 抗原量 接种次数间隔时间单抗的特性抗体滴度 亲和性免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等）106-107个细胞或1-10ug2-4 2-4周 高 中等至强免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高 中等

5、或强免疫原性弱A.20-400ug 2-4随后2-3每月2-3月中等 强B.10-50ug其后200-400ug2其后4每月每天中等 中等C.10-100ug 2其后4其后“休息”最后加强每月10天1-2月中等 中等或强表6-1 不同(b tn)免疫抗原的免疫程序（引自刘秀梵，1994）第12页/共64页第十三页，共64页。培养液：RPM1640培养液DMEM培养液（三）细胞融合第13页/共64页第十四页，共64页。细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商(chngshn

6、g)、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题第14页/共64页第十五页，共64页。培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行(jnxng)传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80或液氮及干冰中第15页/共64页第十六页，共64页。取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过(tnggu)颈脱位致死小鼠，浸泡于 75%酒精中5分钟通常每只小鼠1108-2.5108 个

7、脾细胞，每只大鼠脾脏可得 5108-10108 脾细胞。免疫脾细胞(xbo)的制备：1108的淋巴细胞(xbo)无菌手术第16页/共64页第十七页，共64页。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞其中MQ还有清除(qngch)死亡细胞的作用饲养存活一般不超过 2周，不影响杂交瘤细胞的纯化 在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他(qt)活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞（Feeder cells）。饲养(syng)细胞：第17页/共64页第十八页，共64页。饲养(syng)细胞第18页

8、/共64页第十九页，共64页。融合(rngh)方法a、将1108脾细胞与2107-5107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加(b ji)不完全培养基至30ml，充分混匀。b、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。c、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40 水浴中预热。d、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40 的50%PEG（PH 8.0）1ml，边加边轻轻搅拌。e、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37 的不完全培养基；20-37 静置10分钟。f、1000r/min 5分钟；弃去上清。g、加入5ml HAT培

9、养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加(b ji)含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。h、分装96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将培养板置37，6%CO2培养箱内培养。i、5天后用HAT培养基换出1/2培养基。j、7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。l、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。第19页/共64页第二十页，共64页。1020天出现克隆HAT筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多(zhngdu)的

10、孔中选出来，通常也称为抗体检测。融合细胞的早期(zoq)培养第20页/共64页第二十一页，共64页。常用的抗体(kngt)检测方法：（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定(jindng)单抗。用可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）用全菌抗原的ELISA用全细胞抗原的ELISA抗体捕捉ELISA试验ABC-ELISA试验Dot-ELISA试验免疫组化染色法（2）免疫荧光技术间接免疫荧光法活细胞的膜荧光染色（3）间接血凝试验（4）放射免疫测定第21页/共64页第二十二页，共6

11、4页。HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶(m dn)核苷激酶（四）杂交瘤细胞(xbo)的选择性培养应用(yngyng)液：8-氮杂鸟嘌呤 聚乙二醇第22页/共64页第二十三页，共64页。HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径(tjng)T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径(tjng)合成DNA第23页/共64页第二十四页，共64页。HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT

12、缺乏(quf)，DNA合成的替代途径受阻第24页/共64页第二十五页，共64页。SP2/O:HGPRT-，TK-;长命脾细胞(xbo):HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞(xbo):HGPRT+，TK+;长命骨髓瘤细胞(xbo)、脾细胞(xbo)与杂交瘤细胞(xbo)第25页/共64页第二十六页，共64页。杂交瘤细胞：长期生长繁殖(fnzh)利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖(fnzh)的能力第26页/共64页第二十七页，共64页。有限(yuxin)稀释法(limiting dilution)

13、FACS法（fluorescence activated cell sorter）软琼脂平板法(soft agar method)二、阳性杂交瘤细胞的克隆(k ln)化培养与冻存第27页/共64页第二十八页，共64页。特点：不需任何特殊(tsh)设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.51个细胞有限(yuxin)稀释法每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释(xsh)度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。第28页/共64页第二十九页，共64页。效率(xio l)最高价格昂贵FACS第29页/共64页第三十页，共64页。软琼脂(

14、qingzh)平板法(soft agar method)37、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长(shngzhng)至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的 24孔板，扩大培养。吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。第30页/共64页第三十一页，共64页。配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml)+细胞冻存液(30%40%牛血清，50%60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30-70液氮保存(bocn)数年至数十年“快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞(xbo)的冻存与复苏在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能(knng)发生的意外事故第31页/共64页第三十二页，共64页。防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞(xbo)的过度生长防止细胞(xbo)密度过高而死亡细胞(xbo)冷冻的意义第32页/共64页第三十三页，共64页。