生化工程下游技术第十二章色谱分离课件.ppt

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1、第十二章色谱分离色谱分离又称层析分离 1）利用各组分物理化学性质的差别 2）使各组分不同程度的分布于流动和固定的两相中 3）造成各组分的移动速度产生差别 使各组分相互分离。特点：特点：（1 1）纯化倍数高纯化倍数高（2 2）操作规模小，放大困难操作规模小，放大困难（3 3）终产品纯化终产品纯化（4 4）适用于价格昂贵的产品适用于价格昂贵的产品 色色谱谱分分离离包包括括一一个个流流动动相相（气气相相或或液液相相）和和一一个个固固定定相相，分分离离的的基基础础是是组组分分的的差差速速迁迁移移。在在色色谱谱柱柱中中流流动动相相沿沿固固定定相相流流动动，混混合合物物中中各各组组分分在在此此固固定定相相

2、与与流流动动相相间间的的分分配配不不同同，在在固固定定相相中中相相对对量量多多的的组组分分，与与固固定定相相在在一一起起的的时时间间分分率率大大，随随流流动动相相一一起起流流动动的的速速度度就就慢慢。这这样样，由由于于混混合合物物中中各各组组分分被被固固定定相相滞滞留留的的程程度度不不同同，它它们们随随流流动动相相移移动动的的速速度度就就不不同同（称称为为差差速速迁迁移移），随随流流动动相相移移动动快快的的组组分分先先离离开开色色谱谱柱柱，随随流流动动相相移移动动慢慢的的组组分分后后离离开开色色谱谱柱柱，因因而而可可使使混混合合物物的的各各组分互相分离。组分互相分离。第一节 色谱分离的分类一、

3、根据分离机理分类1、根据分离机理分类 吸附色谱 依靠对固体的吸附作用。分配色谱 依靠溶质在液液两相的溶解分配 离子交换色谱 依靠离子交换作用 位阻排斥色谱 依靠多孔固体或凝胶的排斥效应 亲和色谱 依靠生物分子的专一性结合 凝胶过滤法：樣本樣本固固定定相相流流动动相相小分子被延滯大分子流出較快小分子大分子Stokes radius分子大小、形狀凝胶过滤法的洗脱图谱：目标酶（E）最好不要落在主要蛋白质峰（Y）的范围内V0之前不应有物质洗脱出来Vt之后不应有物质洗脱出来样品分子流动相固定相阳离子基团Counterion阴离子 离子交換法 Anion Exchange亲和层析法四項要素耦合反应杂质洗脱

4、 亲和层析法的作用机理：亲和基团配体固相载体2、按固定相形状不同分类 柱色谱 分离体系采用圆柱管 空柱色谱 色谱柱是空心无阻碍的中心通道形色谱 纸上色谱 固定相是滤纸或将固定相载于纸上 薄层色谱 固定相是一层吸附剂物料，平铺于惰性平板上 置换色谱 在前沿色谱的基础上，用吸附能力最强的组分置换 程序升温色谱 床层温度升高，吸附等温线的斜率减小，有规则的升高色谱柱的温度，有利于吸附力强的组分脱附 阶梯淋洗色谱 用不同离子强度(如pH值或盐浓度等)的溶液有规律地冲洗床层，使性质接近的离子或组分得以分离。5、根据操作压力的不同分类 低压色谱 0.5MPa 中压色谱 0.5 5MPa 高压色谱 5 50

5、MPa 第二节 生物工业中的色谱分离 一、色谱分离的规模 色谱分析：20g/d三、分析色谱与制备色谱和工业色谱的比较 1）应用色谱技术范围的不同 2）操作上的不同 3）色谱分离理论上的不同 理论塔板数的不同 2 分配系数的不同 3 样品保留值与峰高的不同 第四节 色谱分离的基本原理在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为展开展开洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液洗脱液展开后各组分的分布情况称为色谱色谱一、分配色谱 分配色谱分配色谱是利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得以分离，其过程相当于连续性的溶剂抽提。(一)分配系数 在一定条件下，一定量的溶质在两种互不相溶的溶剂

6、中达到平衡时，溶质在两种中的浓度之比为一常数，此常数称为分配系数。分配系数。(二)阻滞因数 溶质在色谱柱(纸、板)中的移动速率与流动相移动速率之比称为阻阻滞滞因因数数，以Rf表示，因而也称为Rf值。Rf=1，溶质不溶于固定相 Rf=0，溶质不溶于流动相 0Rf1，Rf越大，溶质随流动相流动的速度越快(三)塔板理论 同化工原理中的蒸馏操作一样，色谱柱的分离效率也可用塔板理论来描述。二、吸附色谱 吸附现象是表面的一个重要性质之一。固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分于所受的吸引力不相等。表面层所受的作用力小，因而溶质分子在流动过程中碰到固体表面时受到表面剩余力的影响，被吸附而停留下来。三、凝胶

7、色谱分离 凝胶色谱分离具有许多特点：(1)凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，因此分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好；(2)、应用范围广，分离分子量的覆盖面大，可分离从几百到数百万分子量的分子；(3)设备简单，易于操作，周期短，层析剂不需再生即可反复使用，有的可连续使用几百次至上千次。这些优点使凝胶色谱分离已成为一种通用的分离方法，在生物大分子物质的制备与生产技术中被广泛应用。第五节 柱色谱分离法 工业规模的色谱分离大多采用柱色谱分离法，而且吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱等都可在柱中进行，它们的实验装置和操作方法也基本类似。一、层析剂 用于色谱分离技术中

8、的固定相或分离介质，总称为层层析析剂剂。它由基基质质和表表面面活活性性官官能能团(或活动中心)组成。其中，层析剂的基质材料应为化学惰性物质，与目的产物和杂质都无结合作用；活性官能团则根据所用色谱分离方法选用或者制取。层析剂的分类方法很多：1）按化合物的种类可分成无机基质层析剂和有机基质层析剂两大类；2）按色谱分离机理可分成吸附、分配、离子交换、凝胶和亲和层析剂5类；3）按形状可分成球形和无定形两类；4）按硬度可分成硬质层析剂、半硬质凝胶层析剂及一些如琼脂糖的生物软胶；5）按结构可分成表面多孔薄层层析剂和完全多孔层析剂(一)无机基质层析剂 无机基质层析剂常用的基本材料有硅硅胶胶、氧氧化化铝铝、活

9、活性性炭炭、多多孔孔玻玻璃璃、磷磷酸酸钙钙等。将这些无机材料制成适宜应用的球形或无定形颗粒，可直接用于吸附和正相分配色谱。其中有些无机材料经化学修饰或涂层改性后，可制成不同分离机理的层析剂，以满足不同的分离目的。二、装置 柱色谱装置般由进样进样、流动相供给流动相供给、色谱柱色谱柱、检测及流分收集器检测及流分收集器等部分构成，其中色谱柱是色谱分离装置的关键部件。(一)进样及流动相供给装置 在制备型和工业型高效液相色谱中，流动相供给部分一般包括贮贮液液罐罐、高高压压泵泵、液液体体混混合合室室及梯梯度度洗洗脱系统脱系统。(1)具有较高的输出压力。层析剂颗粒越细，色谱柱越长，流动相粘度越大，所需高压泵

10、的输出压力就越高。(2)能使流动相以均匀的流速进入色谱柱，脉冲式进料会使分离效果下降。(3)耐腐蚀性强。(4)泵的死角体积小，以便于迅速更换流动相和梯度洗脱。高压泵高压泵是流动相供给的关键设备，分恒压恒压和恒流恒流两种基本类型。无论采用哪种泵都必须满足下列基本要求：(二二)色谱往色谱往 色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱通通常常用用玻玻璃璃柱柱，这这样样可可直直接接观观察察色色带带的的移动情况，柱应该平直，直径均匀。移动情况，柱应该平直，直径均匀。柱柱的的入入口口端端应应有有进进进进料料料料分分分分布布布布器器器器，使使进进入入柱柱内内的的流流动动相相分分布布均均匀匀并并有有规规则则的的流流型型。柱柱的

11、的底底底底部部部部用用以以支支持持固固定定相相。柱柱的的出出出出口口口口管管管管子子子子应应该该尽尽量量短短些些，这这样样可可以以避避免免已已分分离离的的组组分分重重新新混混合合。在在分分离离生生物物物物质质时时，有有些些色色谱谱柱柱需需带带有有夹夹夹夹套套套套，以以保保持持操操作作过过程程能能在在适适宜宜的的温温度度下下进进行。还有些柱应能进行行。还有些柱应能进行消毒消毒消毒消毒，以免微生物的污染。，以免微生物的污染。柱的分离效率分离效率与柱长柱长成正比，与柱的直径直径成反比，因此色谱柱通常是细长的。柱径柱径的增加可使样品负载量负载量成平方地增加，但柱径大时，流动很难均匀，色带不易规则，因而

12、分离效果差；柱径太小时，进样量少，且使用不便，装柱困难。色谱柱的长度与许多因素有关，包括色谱分离的色谱分离的方法方法、层析剂的种类层析剂的种类、容量和粒度容量和粒度，填装的方法和填填装的方法和填装的均匀度装的均匀度等。就目前采用的匀浆填装技术，填装长度一般不能超过50cm。而大多数色谱柱的长度在25cm左右。层析柱的裝填方法预估体积清洗凝胶缓冲液平衡 温度平衡静置凝胶胶体装填凝胶暂停流洗已堆积尚未沉降加压流洗 沉降紧密 液相柱层析系统缓冲液 梯度混合仪 分步收集器 监视器凝胶床体记录器蠕动泵(三)检测器与流分收集器 通过检检测测器器连续监测柱底出口处液体中各组分的浓度变化，可以了解样品中组分的

13、分辨情况。根据组分的物理化学特性，例如紫紫外外吸吸收收、荧荧光光性性、电电导导率率、旋旋光光性性以及可可见见光光光光密密度度等，选用适当的仪器，进行在线检测。流流分分收收集集器器是将底部流出的液体，每次按一定量分别收集的仪器。有滴滴数数式式、容容量量式式、质质量量式式等若干种。其中以容容量量式式和质质量量式式较为方便实用。在以相对密度不同的洗脱剂依次洗脱时，容量式容量式一般更为有利。三、操作技术(一)样品溶解与进样方法 1）采用色谱方法分离和纯化生物大分子物质时，制制备备合合适适的的样样品品溶溶液液是成败的关键之一。蛋白质类样品的溶解度有限，通常需加其他试剂，以增加它们在水中的溶解度。2）溶剂

14、的性质也必须适应所用的固定相，使使大大量量的的样样品品溶溶液液导导入入色色谱谱往往后后不不马马上上扩扩散散，集集中中在在柱柱头头，以达到“活塞式”进样的目的。3）适宜的进料方法(二)展开操作 样品上柱后，加入洗脱剂，使样品分离并收集目的产物。下面将介绍几种常用的展开方式。1洗脱展开法 洗脱展开法是展开操作中应用最广的一种方法。操作时，先将样品输入色谱柱，随即加入一种不与固定相发生作用的溶剂或几种溶剂的混合物作为流动相冲洗。在洗脱过程中，各组分因与固定相的作用力不同而分离，并随溶剂向下移动，最后有顺序地全部流出色谱柱。根据洗脱过程中洗脱剂的组成是否改变，洗脱展开法可分为如下3种。1）恒定洗脱法

15、恒定洗脱法在整个洗脱过程中不改变洗脱剂的组成。2）逐次洗脱法 此法在洗脱过程中，洗脱剂的组成至少改变一次。3）梯度洗脱法 所谓梯度洗脱法就是逐渐改变洗脱剂的组成，使洗脱条件更有利于混合物的分离，从而消除重叠峰现象。2前沿分析法 在前沿分析法中，样品溶液不是作为一部分进入色谱柱，而是连续不断地输入色谱柱，即样品溶液本身起流动相的作用。只能得到其中作用最弱的纯物质，不能用于混合物的分离。3置换展开法 置换展开法又名顶替法或取代法。置换展开法与洗脱展开法差别不大，其主要的不同之处是样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂作为流动相，去替代结合在固定相表面的溶质分子。四、洗脱色谱动力学（略）

16、五、径向色谱（为解决大直径色谱柱分离效果较差的问题）径向色谱柱的结构及原理如图所示。在径向色谱住中，样品和流动相是从柱的圆周围流向柱圆心。径向色谱有以下特点：1）可在较小的柱床层高度时使用较大的流动相流速；2）圆柱表面积一般大于其横截面积，所以在流动相保持较高的体积速率时，反压降较低；3）当保持制备色谱柱直径不变，只增加柱长时，可以线性增大样品处理量，样品的规模可在保持相似的色谱条件下直接放大，各组分的保留时间及分辨情况与小试时完全相同。亲和色谱 亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。亲和色谱的显著特点是，具有

17、其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。亲和色谱的局限性在于不是任何生物高分子都有特定的配基，针对某一分离对象需要制备专一的配基和选择特定的色谱条件。在亲和色谱分离法中，经常被采用的生物亲和关系如下：酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；抗体：抗原、病毒、细胞；激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素。根据亲和色谱选择性的高低，可将亲和色谱分为专一性和基团性两大类。专一性的

18、配基仅对某种生物物质有特别强的亲和性。基团性的配基则指固定相配基对一类基团有极强的亲和关系，能与许多需要这些辅酶才起催化作用的酶(各种脱氢酶、激酶等)发生亲和结合。基团性亲和色谱具有实用意义，它可以扩大亲和色谱的适应范围.二、亲和层析剂 亲和层析剂的制备过程一般包括3步，即载体(基质)的选择、载体的活化和配基的连接。亲和色谱的理想载体应具有下列特性：不溶性；渗透性，即具有疏松的网状结构，容许大分子自由通过；高硬度及适当的颗粒形式，最好为均匀的珠状；最低的吸附力；较好的化学稳定性；抗微生物和酶的侵蚀；亲水性；具有大量的供反应的化学基团，能与大量配基共价连接。三、亲和色谱操作中的洗脱方法 亲和色谱一般采用柱色谱法。由于生物大分子与配基的作用形式是多种多样的，因此，它们的洗脱条件通常需要通过实验获得。在亲和色谱洗脱操作中，洗脱方法有两类，即普通洗脱法和专一性洗脱法。通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。专一性洗脱法是指溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基，同时对生物活性物质产生竞争性的结合，从而达到洗脱的目的。