基因重组和基因工程课件.ppt

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1、基因重组和基因工程 掌握掌握：基因重组和基因工程的概念，细：基因重组和基因工程的概念，细菌基因转移的接合作用、转化作用和转导作菌基因转移的接合作用、转化作用和转导作用，用，DNADNA克隆、限制性核酸内切酶、基因载体、克隆、限制性核酸内切酶、基因载体、cDNAcDNA文库、基因组文库、基因组DNADNA文库的概念，目的基因文库的概念，目的基因的来源，基因载体的类型，重组的来源，基因载体的类型，重组DNADNA技术的操技术的操作程序。作程序。熟悉熟悉：同源重组、特异位点的基因重组、：同源重组、特异位点的基因重组、转座重组的概念和基本过程，重组转座重组的概念和基本过程，重组DNADNA技术的技术的

2、操作步骤。操作步骤。了解了解：重组：重组DNADNA技术与医学的关系。技术与医学的关系。目目 的的 要要 求求基因重组基因重组 (gene recombination)(gene recombination)是指是指DNADNA片段在细胞内、细胞间，甚至片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。仍然具有复制和表达的功能。基因工程基因工程 (genetic engineering(genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的是指采用人工方法将不同来源的DNADNA进进行重组，并将重组后的行重

3、组，并将重组后的DNADNA引入宿主细胞中引入宿主细胞中进行增殖和表达的过程。进行增殖和表达的过程。基本概念基本概念第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移是经常发生的是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature DNA重组重组位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)转座转座重组重组(transposition recombination)接合作用接合作用 (conjugation)转导作用转导作用 (transduction)同源重组同

4、源重组(homologous recombination)转化作用转化作用 (transformation)发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同同源源重重组组(homologous recombination)，又又称称基基本本重重组组（general recombination）。通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间间进进行单链或双链片段的交换。行单链或双链片段的交换。以以E.coli的的同同源源重重组组为为例例，了了解解同同源源重重组组机机制的制的Holliday模型。模型。一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DN

5、A重组方式重组方式Holliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤：两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant)一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体中间体；通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双中间体切开并修复，形成两个双链重组体链重组体DNA，分别为：分别为：片段重组体片段重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右

6、边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体中间含有一段异源双链区，其两侧组体中间含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图左边产物）：拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本源双链区的两侧来自不同亲本DNA。内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday

7、中间体中间体53535353HolidayHoliday中间体中间体中间体中间体553355335533553355553355553333333355555555333333335555555533333355555555333333335555555533333333内切酶内切酶内切酶内切酶(ruvC)(ruvC)内切酶内切酶内切酶内切酶(ruvC)(ruvC)DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶片片片片段段段段重重重重组组组组体体体体拼拼拼拼接接接接重重重重组组组组体体体体Holliday intermediate的电镜照片的电镜照片二、细菌的基因转

8、移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）（一）接合作用接合作用当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细细菌菌）的的DNA转转移移称称为为接合作用接合作用(conjugation)。有四种方式：有四种方式：接合接合、转化转化、转导转导和和细胞融合细胞融合。可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor)细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。质粒质粒（二）（二）转化作用转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细

9、细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，称为称为转化作用转化作用(transformation)。例例例例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNADNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。（三）（三）转导作用转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（供供体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及基因重组即为转导作用及基因重组即为转导作用(transduction)。噬菌体的生活史噬

10、菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)三、位点特异重组，即特异位点三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合间发生的整合位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特序列的特异位点间发生的整合。异位点间发生的整合。噬噬菌菌体体的的整整合合酶酶识识别别噬噬菌菌体体和和宿宿主主染染色色体体的的特特异异靶靶位位点点发发生生选选择择性性整整合合；反反转转录录病病毒毒整整合合酶酶可可特特异异地地识识别别、整整合合反反转转

11、录录病病毒毒cDNA的的长长末末端端重重复复序序列列(long terminal repeat,LTR)。（一）（一）噬菌体噬菌体DNADNA的整合的整合 噬菌体的重组噬菌体的重组噬菌体的重组噬菌体的重组位点位点位点位点attatt P P与大肠杆与大肠杆与大肠杆与大肠杆菌的重组位点菌的重组位点菌的重组位点菌的重组位点attatt B B之间有之间有之间有之间有15bp15bp核心序核心序核心序核心序列相同，在整合酶列相同，在整合酶列相同，在整合酶列相同，在整合酶（Int）、）、整合酶宿整合酶宿整合酶宿整合酶宿主因子（主因子（主因子（主因子（IHFIHF）作）作）作）作用下发生整合；切用下发生

12、整合；切用下发生整合；切用下发生整合；切除还需要除还需要除还需要除还需要XisXis蛋白的蛋白的蛋白的蛋白的参与。参与。参与。参与。（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组沙门菌沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。沙门菌沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变hixhixhixhix为为为为反反反反向向向向重重重重复复复复序序序序列列列列，它它它它们们们们之之之之间间间间的的的的H H H H片片片片段段段段可可可可在在在在HinHinHinHin控控控控制制制制下下下下进进进进行行行行特特特特异异异异位位位位点点点点重重重重组组组组(倒倒倒倒位位位位)

13、。H H H H片片片片段段段段上上上上有有有有两两两两个个个个启启启启动动动动子子子子P P P P，其其其其一一一一驱驱驱驱动动动动hinhinhinhin基基基基因因因因表表表表达达达达，另另另另一一一一正正正正向向向向时时时时驱驱驱驱动动动动H2H2H2H2和和和和rH1rH1rH1rH1基基基基因因因因表表表表达达达达，反反反反向向向向(倒倒倒倒位位位位)时时时时H2H2H2H2和和和和rH1rH1rH1rH1不表达。不表达。不表达。不表达。rH1rH1rH1rH1为为为为H1H1H1H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。（三）免疫球蛋白基因的重排（三）

14、免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白(IgIgIgIg)，由两条轻链由两条轻链由两条轻链由两条轻链(L(L(L(L链链链链)和两条重链和两条重链和两条重链和两条重链(H(H(H(H链链链链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其组成，分别由三个独立的基因族编码，其组成，分别由三个独立的基因族编码，其组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链中两个编码轻链中两个编码轻链中两个编码轻链(和和和和 )，一个编码重链。，一个编码重链。，一个编码重链。，一个编码重链。轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 重重重重

15、链链链链(IgHIgH)基基基基因因因因的的的的V-D-JV-D-J重重重重排排排排和和和和轻轻轻轻链链链链(IgLIgL)基基基基因因因因的的的的V-JV-J重重重重排排排排均均均均发发发发生生生生在在在在特特特特异异异异位位位位点点点点上上上上。在在在在V V片片片片段段段段的的的的下下下下游游游游，J J片片片片段段段段的的的的上上上上游游游游以以以以及及及及D D片片片片段段段段的的的的两两两两侧侧侧侧均均均均存存存存在在在在保保保保守守守守的的的的重重重重组组组组 信信信信 号号号号 序序序序 列列列列(recombination(recombination signal signa

16、l sequence,sequence,RSS)RSS)。此此重重排排的的重重组组酶酶基基因因rag(recombination activating gene)共共有有两两个个，分分别别产产生生蛋蛋白白质质RAG1和和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCCACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGGGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开

17、单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免免疫疫球球蛋蛋白白基基因因重重排排过过程程四、四、转座转座重组重组大多数基因在基因组内的位置是固定大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因从一个位置移动到另的，但有些基因从一个位置移动到另一位置。这些可移动的一位置。这些可移动的DNA序列包括序列包括插入序列和转座子。插入序列和转座子。由插入序列和转座子介导的基因移位由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为或重排称为转座转座(transposition)。插入序列插入序列(insertion sequences,IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列（一

18、）插入序列二个反向重复二个反向重复(inverted repeats,IR)序列序列特有的正向重复序列特有的正向重复序列一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)是插入序列从原位迁至新位。是插入序列从原位迁至新位。是插入序列复制后，其中的一个复制是插入序列复制后，其中的一个复制本迁移至新位，另一个仍保留在原位。本迁移至新位，另一个仍保留在原位。插插入入序序列列的的复复制制性性转

19、转座座转座子转座子(transposons)从一个染色体从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRIRIRTransposaseTransposase Gene Gene有用基因有用基因有用基因有用基因（二）转座子转座（二）转座子转座转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座

20、酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L由转座子介导的转座由转座子介导的转座DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 第二节第二节 重组重组DNA技术技术,又称又称DNA克克隆或分子克隆隆或分子克隆重组重组DNA技术的发展史技术的发展史18651865年年年年 G.J.MendelG.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1

21、9441944年年年年 O.T.AveryO.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。19731973年年年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNADNA分子。分子。分子。分子。19771977年年年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，应用重组工程公司，应用重组工程公司

22、，应用重组工程公司，应用重组DNADNA技术制造医学上重要药物。技术制造医学上重要药物。技术制造医学上重要药物。技术制造医学上重要药物。19801980年年年年 建造第一家应用重组建造第一家应用重组建造第一家应用重组建造第一家应用重组DNADNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。19971997年年年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。转基因猪进行人体器官移植转基因猪进行人体器官移植由于猪的器官，如由于猪的器官，如心脏与心脏与人的大小和活动能力类

23、似，人的大小和活动能力类似，且猪的数量充足，容易繁且猪的数量充足，容易繁殖殖，可以充分满足临床需，可以充分满足临床需要，被医学界认为是人类要，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者。器官移植的最佳提供者。在人体器官移植手术中，在人体器官移植手术中，灵长类猿猴的内脏普遍为灵长类猿猴的内脏普遍为人们所看好。但医学研究人们所看好。但医学研究发现，猿猴身上的一些病发现，猿猴身上的一些病毒对人类十分有害。毒对人类十分有害。图：美国哈佛医学院的研究人员正将一头猪的肝脏取出来，为一位肝昏迷患者作替代肝脏。通过基因工程手段，通过基因工程手段，将猪的一个能引发人体将猪的一个能引发人体排斥反应的基因排斥反应的基因

24、-GT-GT基因基因被关闭被关闭 ，使猪的器官成，使猪的器官成功移植到人体内的可能功移植到人体内的可能性大大增加。性大大增加。GTGT基因控制产生一基因控制产生一种酶，这种酶使猪细胞种酶，这种酶使猪细胞表面产生一种蛋白质。表面产生一种蛋白质。当猪的器官移植进人体当猪的器官移植进人体时，人类免疫系统能识时，人类免疫系统能识别这种蛋白质，从而产别这种蛋白质，从而产生强烈的排异反应。生强烈的排异反应。水母利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊把白蛋白基因转入着乳腺中，这样，转入的白蛋白基因在羊乳腺中表达。通过其分泌不断产生白蛋白。通过分离、纯化，可以得到药用白蛋白，解决临床上病

25、人对白蛋白的需求。把大鼠生长因子转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。转基因抗冻西红柿转基因抗冻西红柿transgenic anti-chilling tomatoestransgenic anti-chilling tomatoes转转转转鱼基因鱼基因鱼基因鱼基因番茄是将美洲拟番茄是将美洲拟番茄是将美洲拟番茄是将美洲拟蝶鱼的抗寒基因转入番茄蝶鱼的抗寒基因转入番茄蝶鱼的抗寒基因转入番茄蝶鱼的抗寒基因转入番茄的染色体上，该品种具有的染色体上，该品种具有的染色体上，该品种具有的染色体上，该品种具有耐寒（植株的致死温度下耐寒（植株的致死温度下耐寒（植株的致死温度下耐寒（植株的致死温度下降降降降2222）、

26、高产（产量增加）、高产（产量增加）、高产（产量增加）、高产（产量增加18181818以上）、优质（果实以上）、优质（果实以上）、优质（果实以上）、优质（果实维生素维生素维生素维生素C C C C含量增加含量增加含量增加含量增加151515155 5 5 5）、抗病等优点。、抗病等优点。、抗病等优点。、抗病等优点。延熟保鲜的转基因番茄转基因延熟保鲜的转基因番茄转基因（transgenic anti-ageing tomatoestransgenic anti-ageing tomatoes）通过反义技术，封通过反义技术，封闭乙烯合成酶闭乙烯合成酶（ACCACC）基因的表基因的表达，没有基因产物达

27、，没有基因产物.转抗虫转抗虫基因基因BtBt烟草植株的抗虫效果烟草植株的抗虫效果Golden rice（黄金米）（黄金米）vitamin A=retinol-vitamin A=retinol-produced by animals in produced by animals in liver,milk and eggsliver,milk and eggsplants do not produce plants do not produce vitAvitA-but some produce-but some produce-carotene,a precursor for caroten

28、e,a precursor for vitAvitA including“yellow including“yellow vegetables”,yellow vegetables”,yellow endosperm corn and endosperm corn and sorghumsorghumin many developing in many developing countries,countries,vitAvitA deficiency is deficiency is a major problem:a major problem:基因工程与药物研制基因工程与药物研制我国生产

29、的部分基因我国生产的部分基因我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物工程疫苗和药物工程疫苗和药物许多药品的生产许多药品的生产许多药品的生产许多药品的生产是从生物组织中提取是从生物组织中提取是从生物组织中提取是从生物组织中提取的。受材料来源限制的。受材料来源限制的。受材料来源限制的。受材料来源限制产量有限，其价格往产量有限，其价格往产量有限，其价格往产量有限，其价格往往十分昂贵。往十分昂贵。往十分昂贵。往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产

30、。若将生物合成相应药物成分的基因导业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。能解决产量问题，还能大大降低生产成本。能解决产量问题，还能大大降低生产成本。能解决产量问题，还能大大降低生产成本。胰岛素从猪、牛等动物的胰胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，腺中提取，100Kg100Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g

31、4-5g的胰岛素，其产量之低和价的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。格之高可想而知。将合成的胰岛素将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，基因导入大肠杆菌，每每2000L2000L培养液就能培养液就能产生产生100g100g胰岛素！使胰岛素！使其价格降低了其价格降低了30%-30%-50%!50%!环境保护环境保护基因工程做成的基因工程做成的基因工程做成的基因工程做成的“超级细菌超级细菌超级细菌超级细菌”能吞食和分解多能吞食和分解多能吞食和分解多能吞食和分解多种污染环境的物质。种污染环境的物质。种污染环境的物质。种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因通常一种细菌只能分解石油

32、中的一种烃类，用基因通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的工程培育成功的工程培育成功的工程培育成功的“超级细菌超级细菌超级细菌超级细菌”却能分解石油中的多种烃却能分解石油中的多种烃却能分解石油中的多种烃却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDTDDTDDTDDT等毒害物质。等毒害物质。等毒害物质。等毒害物质。利用基因工程培育的利用基因工程培育的“指示生物指示生物”

33、能十分能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。相关概念相关概念 DNA克隆克隆 工具酶工具酶 目的基因目的基因 基因载体基因载体基本原理基本原理及操作步骤及操作步骤 本节主要内容：本节主要内容：一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一）DNADNA克隆克隆应应

34、用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或或重重组组DNA(recombinant DNA)。DNADNA克隆克隆 目的：目的：分离获得某

35、一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组称基因工程，又称重组DNA工艺学。工艺学。（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶基因工程基因工程基因工程基因工程的手术刀！的手术刀！的手术刀！的手术刀！重组重组DNA技术中常用的工具

36、酶技术中常用的工具酶工工工工 具具具具 酶酶酶酶功功功功 能能能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶催化催化催化催化DNADNA中相邻的中相邻的中相邻的中相邻的55磷酸基和磷酸基和磷酸基和磷酸基和33羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使酯键，使酯键，使DNADNA切口封合或使两个切口封合或使两个切口封合或使两个切口封合或使两个DNADNA分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接

37、分子或片段连接DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶合成双链合成双链合成双链合成双链cDNAcDNA分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析填补填补填补填补33末端末端末端末端KlenowKlenow片段片段片段片段又名又名又名又名DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I大片段，具有完整大片段，具有完整大片段，具有完整大片段，具有完整DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I的的的的5 53 3 聚合、聚合、聚合、聚合、3 35 5 外切活性，而无

38、外切活性，而无外切活性，而无外切活性，而无5 53 3 外切活外切活外切活外切活性。常用于性。常用于性。常用于性。常用于cDNAcDNA第二链合成，双链第二链合成，双链第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3DNA 3 末端标记等末端标记等末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶合成合成合成合成cDNAcDNA替代替代替代替代DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I进行填补，标记或进行填补，标记或进行填补，标记或进行填补，标记或DNADNA序列分析序列分析序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸催化多聚核

39、苷酸55羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶在在在在33羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在

40、识识别别位位点点切切割割双双链链DNA的的一一类类内内切切酶酶。存在细菌体内。存在细菌体内。Bam HGGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGGGCCTAGCCTAGGATCCGATCC G G+定义：定义：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中基因工程技术中常用常用型型）分类：分类：1800+种种作用：作用：例如：例如：EcoR I、BamH I等就属于这类酶。等就属于这类酶。第一个字母第一个字母第一个字母第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用取自产生该酶的细菌属名，用取自产生该酶

41、的细菌属名，用取自产生该酶的细菌属名，用大写大写大写大写；第二、第三个字母第二、第三个字母第二、第三个字母第二、第三个字母是该细菌的种名，用是该细菌的种名，用是该细菌的种名，用是该细菌的种名，用小写小写小写小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属属属 系系系系 株株株株 序序序序HHaemophilusaemophilus ininfluenzae fluenzae d d株株株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌流感嗜

42、血杆菌流感嗜血杆菌d d株的第三种酶株的第三种酶株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam Bam HHGTCGTCCAGCAGGGCCTAGCCTAGGATCCGATCC G G+GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGHindGTCGACGTCGACCAGCTGCAGCTGGACGACCTGCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点同一位点，这些酶称同功异源酶。，这些酶称同功异源酶。G

43、GATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGGGCCTAGCCTAGGATCCGATCC G G+Bam Bam HHGGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGGGCCTAGCCTAGGATCCGATCC G G+BstBst同功异源酶：同功异源酶：有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称为同尾酶。，称为同尾酶。Bam Bam HHBgBg l l GGATCC GGATCC CCTAGG CCTAGG AGATCT AGATCT TCTAGA TCTAGAGGC CCTAGCTAG

44、GATCGATCC C G G+A AT TCTAGCTAG GATCGATCT T A A 同尾酶同尾酶名称名称 识别识别序列及切割位点序列及切割位点名称名称识别识别序列及切割点序列及切割点切割后切割后产产生生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoREcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3 AGCTT.3 HpaHpa 5CCGG.3 CGG.3 MboMbo 5GATC.3 GATC.3 NdeNde 5GATATG.3TATG.3切割后切割后产产生生3突出末端突出末端:Apa 5G

45、GGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPyPy.3.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后切割后产产生平末端生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3HaeHae 5GGCC.3CC.3PvuPvu 5CAGCTG.3CTG.3SmaSma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（三）目的基因（三）目的基因(target gene)(target gene)cDNA(complementary DNA)指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA(通常指通常指mR

46、NA或病毒或病毒RNA)互补的单链互补的单链DNA。以。以单链单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双为模板、经聚合反应可合成双链链cDNA。基因组基因组DNA(genomic DNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。（四）基因载体（四）基因载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些表达蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。载体按功能分为载体按功能分为 克隆载体克隆载体(cloning vector)表达载体表达载体(expression ve

47、ctor)克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特意设计的载体称为克隆载体。特意设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可序列可转录转录翻译翻译成多肽链而特意设计的载体称为成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。表达载体。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA载体的选择标准：载体的选择标准：能能自主复制自主复制；具有两个以上的具有两个以上的遗传标记遗传标记，便于重组体的，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定；有有克隆位点克隆位点（外

48、源（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小分子量小，以容纳较大的外源以容纳较大的外源DNA。1.质粒质粒(plasmid):特特点点:能能在在宿宿主主细细胞胞内内自自主主复复制制；带带有有某某些些遗传信息遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。是存在于是存在于细菌染色体外细菌染色体外的具有自主复的具有自主复制能力的小型制能力的小型环状双链环状双链DNA分子。分子。l最最早早使使用用的的质质粒粒DNADNA是是人人工工构构建建的的pBR322pBR322，该该质质粒粒分分子子大大小小为为4.

49、3kb4.3kb，带带有有抗抗四四环环素素和和抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素基基因因，含含EcoREcoR，BamHBamH，HindHind等单一的限制酶切位点。等单一的限制酶切位点。2.2.噬菌体噬菌体(bacteriophage，phage)噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组噬菌体由头和尾构

50、成，感染时尾管将基因组噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNADNADNADNA注入注入注入注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。具有具有具有具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型载体，适用系列（插入型载体，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型载体，适用基因组克隆）系列（置换型载体，适