法医学-法医DNA分型课件.ppt

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1、第18章 法医DNA分型 法医物证学 基本概念：对涉及法律问题的生物性检材进行检验，解决 个人识别和亲权鉴定问题的法医学分支学科 基本任务：个人识别-揭示个体身份 亲权鉴定-判定备检者之间是否存在生物学亲缘关系 一、基本概念：1.基因(gene)：染色体上一段特定的DNA片段。2.基因座/位点(locus)：基因在染色体上的特定位置。3.等位基因(allele):一个基因座上的基因存有DNA一级结构差异。4.基因型(genetype)：基因座上成对等位基因的组合。5.表型(phenotype)：通过一定手段观察到的个体性状。法医常用遗传标记 遗传标记的检测方法：?血清学方法 检验红细胞血型、白

2、细胞血型、红细胞酶型、血清型?DNA检验技术 RFLP技术、PCR技术 二、DNA水平的遗传标记 1、DNA的分子结构 DNA的二级结构-双螺旋结构 1953年，Watson 和Crick 提出了DNA双螺旋结构模式。变性：双链间氢键的断裂，形成两条多核苷酸单链的过程 引起DNA变性的因素主要有高温、强酸强碱、有机溶剂等。DNA变性后，性质发生改变。核酸分子杂交(hybridization)根据核酸分子变性及复性的性质，通过碱基配对使不同来源的两条多核苷酸链相互结合。在某些因素的影响下，例如紫外线、DNA酶等，可以使DNA分子中的 磷酸二酯键断裂，形成多个分子量更小的DNA片段，这个过程叫作D

3、NA降解。2、DNA多态性 等位基因（或DNA片段）存在 两种以上形式，且每种等位基因 频率0.01，本质为碱基构成发生改变（点突变、缺失、插入或置换），分为长度多态性和序列多态性。DNA长度多态性 由同一基因座上各等位基因之间DNA片段长度差异构成的多态性。DNA序列多态性 基因组DNA核苷酸序列在个体排列上存在巨大差异，这种差异形成DNA片段序列多态性。单核苷酸多态性（SNP）人类基因组范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1%小卫星DNA：一类由10-100bp长度重复单位形成的卫星DNA，序列总长度100-20kb，又称可变数目串联

4、重复序列（VNTR）形成机制主要是不等交换 微卫星DNA：一类由2-6bp长度重复单位形成的卫星DNA，串联重复10-60次，总长度多小于300bp，又称短串联重复序列（STR），形成机制主要为复制滑脱 线粒体基因组（mtDNA）?母系遗传?单倍型遗传?多拷贝?突变率高?高度多态性?异质性 3、DNA多态性检测技术 限制片段长度多态性（RFLP）限制性内切酶：识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定部位以内切方式水解DNA链的核酸水解酶。由于DNA限制酶识别的序列核苷酸结构发生改变，导致酶切位点的产生、消失或移位，酶切所产生的限制性片段数目和长度改变所呈现出的DNA多态性。RFLP试验流程

5、图 DNA纹印：RFLP分析杂交时使用单基因座探针，高度严格杂交条件下，仅与一个小卫星基因座等位片段杂交，形成单基因座RFLP图谱。DNA指纹：RFLP分析杂交时，使用多基因座探针，不严格杂交条件下，与多个小卫星基因座等位片段杂交，形成多基因座RFLP图谱。英国科学家 Jeffreys 采用PCR扩增VNTR或STR基因座等位基因进行DNA长度多态性分析的方法。扩增片段长度多态性分析（amp-FLP）：聚合酶链式反应(PCR)原理：模拟天然DNA复制的体外DNA扩增方法。以基因组DNA为模板,以一对寡核苷酸为引物,dNTP为原料,在耐热多聚酶存在下，反复经过变性、退火、引物延伸三个步骤,使靶D

6、NA片段得到复制。变性(denaturation)：加热至95，使模板DNA双链的氢键断裂而解离成两条单链。退火(annealing)：降温至55左右，引物寡核苷酸与模板DNA互补序列复性，形成模板-引物杂交双链。两引物的3端彼此相对。延伸(extension)：升温至72，在耐热DNA聚合酶的作用下，以碱基配对原则，dNTP逐个连接在引物的3端。引物由5端3端方向被延伸、合成与靶DNA序列互补的DNA新链。经过变性?退火?延伸的一次循环，靶DNA片段被复制一次。新合成的DNA链又可成为下一循环的模板。经过n次循环后，产生在两引物间的靶DNA短片段数量为2n-2n条。30次循环后，理论上DNA

7、拷贝数可达105-107。PCR产物经电泳分离，显带 杂合子为两条长度不等的片段，纯合子为一条片段；根据片段长度判定等位基因和基因型 1.高灵敏度，适于陈旧、降解、腐败检材；2.特异性高；3.可复合扩增；4.种属特异性；5.实验周期短，设备条件和操作相对简单。PCR技术用于法医学的特点 短串联重复序列（STR）：广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，基序为2-6bp，串联重复10-60次，总长度多小于300bp，形成机制主要为复制滑脱。STR基因座命名原则：?编码区，依据所在基因名称命名?非编码区，依据首次进入公共数据库的序号命名 STR基因等位基因命名原则：?等位基因根据所

8、含重复单位数目命名等位基因。?含有不完整基序的等位基因命名：在完整等位基因数后面加一小数点，小数点后面为不完整序列含有的碱基数。Ladder 5-12 Ladder 5-12 Ladder 5-12 1 2 3 4 5 6 基因型 1:(8,8);2:(8,10)3:(8,8);4:(7,9)5:(8,8);6:(8,9)CSF1PO D5S818 D21S11 TH01 TPOX D13S317 D7S820 D16S539 D18S51 D8S1179 D3S1358 FGA VWA AMEL AMEL 性别基因 美国联合DNA检索系统（CODIS）的13个 STRs 应用于法医的STR应

9、满足以下条件?PCR扩增产物长度在300bp以下?宜选择四核苷酸STR基因座?选多个STR基因座应不在同一条染色体上?每个STR基因座等位基因数8-10个左右?基因频率分布均匀，没有高或低频基因出现?杂合度高，最好大于0.80；?低突变率0.2%。多基因座复合扩增（multiplex amplification）?在一个PCR体系中同时扩增多个基因座?如果同时检测816个STR基因座，鉴别能力能够达到DNA指纹的水平。?优点：高效、经济、快速。?目前常用的复合扩增方法有两种：银染系统、多色荧光自动检测系统 银染系统 多基因座复合扩增产物电泳分离后，PAG凝胶直接用银染显带。体系中多个基因座的基

10、因长度范围必须互不重叠。操作简单，经济实用。因为片段长度范围选择受限制，能够同时扩增的基因座个数有限。荧光标记的自动检测系统 常采用复合扩增即在同一反应管中同时扩增多个STR基因座，自动化的激光荧光检测系统进行PCR产物分型 原理：荧光染料标记在一条PCR引物的5端，在PCR扩增时，PCR产物带上荧光标记。电泳时，标记有荧光染料的DNA片段由激光诱发荧光而被检测。D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 D18S51 TPOX VWA AMEL D5S818 FGA GS500 LIZ s

11、ize standard 6FAM(blue)VIC(green)NED(yellow)PET(red)LIZ(orange)AmpFlSTR?Identifiler?法医遗传学应用STR的特点在于：?高灵敏度?扩增的片段短?使用生物检材类型广泛?分型简单，可标准化?染色体定位明确 PCR-STR：国内外法医个人识别和亲子鉴定的主流技术 长度多态性分型局限性 案发现场只发现有头发或长期暴露于外界环境的骨骼，这些检材中核DNA含量很少或降解，无法进行长度多态性（如STR）分型。?PCR-ASO技术HLA-DQAl 基因座?PCR-RFLP技术ABO基因、mtDNA?DNA序列分析mtDNA分型

12、法医学上常用的序列多态性分析技术 PCR-RFLP技术 利用两个片段之间的序列差异，而且这种差异刚好构成一个限制性核酸内切酶识别位点，或使原有的限制酶识别位点丢失或识别位点移动了位置，选择合适的限制酶切割PCR产物，从长度不一的DNA酶切片段，可以判断等位基因及基因型。DNA序列分析（一）Sanger双脱氧末端终止法（二）循环测序（cycle sequencing）（三）荧光标记循环测序全自动分析 排除 不排除/认定 个人识别的系统效能 遗传标记 同一人？未知样本Q 已知样本K 个人识别能力(discrimination power,DP)：指从群体中随机抽取两名个体，其遗传标记表型不相同的概

13、率。?评价该遗传标记系统识别无关个体效能大小的指标，即反应遗传标记区分不同人的能力；?遗传标记的多态性越高，个人识别能力越强，遗传标记的效能就越高。遗传标记个人识别的系统效能 计算公式 式中 n 为一个遗传标记的表型数目，Pi 为群体中第 i 个表型的频率。Pi 2 为人群中随机抽取的两个样本，纯粹由于机会而一致的概率(Q)。累积个人识别能力（TDP）遗传标记数目越多，个人识别能力愈强。提高系统的个人识别能力可以通过增加检测的遗传标记数目来实现。若检测k个遗传标记，其累积个人识别能力计算公式为：一名随机个体碰巧与作为证据的检材表型匹配的可能性，又称为随机匹配概率或随机个体碰巧匹配概率。是对一个

14、特定的（组合）遗传标记表型可能出现在人群中的概率，也可以说是从一个人群中随机抽取一个样本，会出现特定表型的理论概率。匹配概率（probability of match,Pm）Pm的意义?当两份检材的遗传标记表型匹配时，如果现场检材不是嫌疑人留下的，而是一个从 群体中随机抽出的个体留下的，遇到这种个体的 可能性有多大。?这个概率越小，遇到这种个体的可能性就越小，说明现场检材与嫌疑人样本的表型匹配非常不像是一个随机事件，而是 支持这两个样本来自同一个人的假设，也就是支持现场检材是嫌疑人留下的假设。似然率（likelihood,LR）似然率基于两个表型组合来自同一个体的假设衡量证据的强度。?例如，现场血痕DNA和嫌疑人血液DNA表型组合均为X，可以考虑两种假设：现场血痕是嫌疑人所留（原告假设）；现场血痕是一个与案件无关的随机个体所留（被告假设）。?似然率是假设条件下现场血痕与嫌疑人的表型 组合都是 X 的概率 Pr（EHp）=1；与假设条件下现场血痕与嫌疑人的表型组合都是 X 的概率（Pr（EHd）=P（X）之 比，即 LR=1/P（X）谢 谢！