毛细管电泳学习教案.pptx

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1、会计学1毛细管电泳毛细管电泳第一页，编辑于星期二：一点 十八分。概述概述概述概述 电电泳泳：溶溶液液中中的的带带电电粒粒子子（离离子子、胶胶粒粒或或分分子子）在在电电场场中中的的定向迁移现象。定向迁移现象。物理化学现象。物理化学现象。毛毛细细管管电电泳泳（又又称称高高效效毛毛细细管管电电泳泳）（HPCE HPCE），是是一一类类以以毛毛细细管管为为分分离离通通道道、以以高高压压直直流流电电场场为为驱驱动动力力的的新新型电泳分离技术。型电泳分离技术。包含电泳、色谱及其交叉内容。包含电泳、色谱及其交叉内容。电泳法电泳法（electrophoresiselectrophoresis）以电泳为基础的分

2、离分析）以电泳为基础的分离分析方法。方法。第1页/共135页第二页，编辑于星期二：一点 十八分。n n电泳法的发展史电泳法的发展史(Phylogeny)(Phylogeny)：n n电泳现象早在电泳现象早在电泳现象早在电泳现象早在18181818世纪就被发现世纪就被发现世纪就被发现世纪就被发现。n n1909190919091909年，年，年，年，L.MichaelisL.MichaelisL.MichaelisL.Michaelis提出提出提出提出“电泳电泳电泳电泳 (electrophoresiselectrophoresiselectrophoresiselectrophoresis)”

3、)”)”)”这一术语，他的实验是用这一术语，他的实验是用这一术语，他的实验是用这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的等电点。于测定蛋白质的等电点。于测定蛋白质的等电点。于测定蛋白质的等电点。n n1937193719371937年，年，年，年，瑞典科学家瑞典科学家瑞典科学家瑞典科学家A.Tiselius A.Tiselius A.Tiselius A.Tiselius 成功研制出界面电成功研制出界面电成功研制出界面电成功研制出界面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的泳仪，并建立了移动界面电泳法

4、，用于人血清蛋白的分离。分离。分离。分离。n nTiseliusTiseliusTiseliusTiselius于于于于48484848年获诺贝尔化学奖。年获诺贝尔化学奖。年获诺贝尔化学奖。年获诺贝尔化学奖。第2页/共135页第三页，编辑于星期二：一点 十八分。n n花絮花絮n n19371937年，年，年，年，Tiselius(Tiselius(瑞典瑞典瑞典瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血之间，两端施以电

5、压进行自由溶液电泳，第一次将人血之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；球蛋白；球蛋白；球蛋白；n n发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；n n第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；n n 19481

6、948年，获诺贝尔化学奖；年，获诺贝尔化学奖；年，获诺贝尔化学奖；年，获诺贝尔化学奖；1.经典电泳技术经典电泳技术 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫的方法和技术叫电泳法或电泳技术电泳法或电泳技术。经典电泳法经典电泳法自由界面电泳自由界面电泳（无载体电泳）无载体电泳）区带电泳（有载体支持电泳）区带电泳（有载体支持电泳）第3页/共135页第四页，编辑于星期二：一点 十八分。n n界面电泳界面电泳界面电泳界面电泳 ：在没有惰性支持物的液体接界面上进行：在没有惰性支持物的液体接界面上进行：在没有惰性支持物的液体接界面上进行：在没有惰

7、性支持物的液体接界面上进行的电泳。的电泳。的电泳。的电泳。缺点：缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难对流较严重，组分不能完全分离，检测困难第4页/共135页第五页，编辑于星期二：一点 十八分。n n区区区区带带带带电电电电泳泳泳泳：是是是是在在在在溶溶溶溶液液液液中中中中加加加加入入入入一一一一些些些些惰惰惰惰性性性性物物物物质质质质或或或或凝凝凝凝胶胶胶胶物物物物质质质质作作作作为为为为支支支支持持持持物物物物，泳泳泳泳动动动动物物物物质质质质在在在在支支支支持持持持物物物物间间间间隙隙隙隙中中中中移移移移动动动动的的的的电电电电泳泳泳泳方方方方法。法。法。法。避免对流的干扰。避免对

8、流的干扰。避免对流的干扰。避免对流的干扰。纸电泳纸电泳醋酸纤维素电泳醋酸纤维素电泳淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 第5页/共135页第六页，编辑于星期二：一点 十八分。n n常压电泳：常压电泳：常压电泳：常压电泳：电位梯度电位梯度电位梯度电位梯度 50V/cm 50V/cm 50V/cm 50V/cmn n高压电泳：高压电泳：高压电泳：高压电泳：电位梯度电位梯度电位梯度电位梯度 50V/cm 50V/cm 50V/cm 50V/cm影响因素：影响因素：电荷效应溶液pH值离子强度和温度电渗1.载体性质和分子筛电泳速度电泳速度电场强电场强度度V/L

9、(V/m)电泳速率电泳速率第6页/共135页第七页，编辑于星期二：一点 十八分。传统电泳的缺陷：传统电泳的缺陷：传统电泳的缺陷：传统电泳的缺陷：（1 1）焦焦焦焦耳耳耳耳热热热热效效效效应应应应：电电电电流流流流通通通通过过过过电电电电泳泳泳泳介介介介质质质质而而而而产产产产生生生生的的的的热效应。热效应。热效应。热效应。使使使使电电电电泳泳泳泳分分分分离离离离介介介介质质质质温温温温度度度度分分分分布布布布不不不不均均均均匀匀匀匀，引引引引起起起起溶溶溶溶液液液液对对对对流流流流，从从从从而而而而导导导导致致致致区区区区带带带带展展展展宽宽宽宽，降降降降低低低低分分分分离离离离效效效效率率率

10、率。焦焦焦焦耳耳耳耳热热热热效效效效应应应应随随随随电电电电场场场场强强强强度度度度的的的的增增增增大大大大而而而而迅迅迅迅速速速速加加加加剧剧剧剧，限限限限制制制制了了了了高高高高电压的使用。电压的使用。电压的使用。电压的使用。（2 2）无法在线检测，定量精度较差）无法在线检测，定量精度较差）无法在线检测，定量精度较差）无法在线检测，定量精度较差。第7页/共135页第八页，编辑于星期二：一点 十八分。2.2.2.2.高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术19811981年，年，Jorgenson和和Luckas，用，用7575 m m内径的石内径的石英毛细管

11、电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高达英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高达4040万万/m/m，使电泳技术发生了根本变革，迅速发展，使电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与成为可与GCGC、HPLCHPLC相媲美的崭新的分离分析技术相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。高效毛细管电泳。毛细管电泳：毛细管电泳：使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，使焦耳热效应减小，能使用高电压，全面改善分离质量和提高分析速度。第8页/共135页第九页，编辑于星期二：一点 十八分。总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点有总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点有四个：四个：高效、快速、微量和自动化。高

12、效、快速、微量和自动化。毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大大减毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，小了温度效应，可以可以使用使用很高的很高的电压。电压。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内径电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内径变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块/米，米，特殊柱子可以达到数百万。特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进：一、采用了一、采用了50 50 m内径的毛细管；内径的毛细管；二、采用了高达数千伏的高电压；二、采用了高达数千伏的高电

13、压；三、实现了高灵敏度的在线检测。三、实现了高灵敏度的在线检测。第9页/共135页第十页，编辑于星期二：一点 十八分。n n1981198119811981年年年年，JorgensonJorgensonJorgensonJorgenson和和和和LukacsLukacsLukacsLukacs 使使使使用用用用75m75m75m75m内内内内径径径径的的的的熔熔熔熔融融融融石石石石英英英英毛毛毛毛细细细细管管管管，电电电电泳泳泳泳分分分分离离离离氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸和和和和肽肽肽肽，成成成成为为为为高高高高效效效效毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳划划划划时时时时代代代代的的的的里里

14、里里程程程程碑碑碑碑。至至至至此此此此，出出出出现现现现了了了了毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳技技技技术。术。术。术。n n80808080年年年年代代代代以以以以来来来来，诞诞诞诞生生生生了了了了很很很很多多多多新新新新的的的的毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳方方方方法法法法，如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。n n88888888年年年年商商商商品品品品化化化化HPCEHPCEHPCEHPCE问问问问世世世世，高高高高灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度柱柱柱柱上上上

15、上检检检检测测测测器器器器的的的的发发发发展展展展使使使使HPCEHPCEHPCEHPCE在在在在世世世世界界界界范范范范围围围围内内内内蓬蓬蓬蓬勃勃勃勃开开开开展展展展。HPCEHPCEHPCEHPCE已已已已成成成成为为为为电电电电泳领域发展最快的新分支。泳领域发展最快的新分支。泳领域发展最快的新分支。泳领域发展最快的新分支。毛细管电泳的发展毛细管电泳的发展 第10页/共135页第十一页，编辑于星期二：一点 十八分。高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较（1 1 1 1）分离过程：）分

16、离过程：）分离过程：）分离过程：相同相同相同相同 HPCE HPCE HPCE HPCE 与与与与HPLC HPLC HPLC HPLC 都都都都是是是是一一一一种种种种液液液液相相相相分分分分离离离离分分分分析析析析技技技技术术术术。都都都都是是是是差差差差速速速速迁迁迁迁移移移移过过过过程程程程，可可可可用用用用相相相相同同同同的的的的理理理理论论论论来来来来描描描描述述述述,如如如如保保保保留留留留值值值值、塔塔塔塔板板板板理论和速率理论等。理论和速率理论等。理论和速率理论等。理论和速率理论等。（2 2 2 2）分离原理：）分离原理：）分离原理：）分离原理：不同（不同（不同（不同（驱动力

17、不同驱动力不同驱动力不同驱动力不同）HPCEHPCEHPCEHPCE：带带带带电电电电粒粒粒粒子子子子在在在在电电电电场场场场中中中中发发发发生生生生定定定定向向向向移移移移动动动动，依依依依据据据据粒粒粒粒子子子子所所所所带带带带电电电电荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。HPLCHPLCHPLCHPLC：不同组分在两相中的分配系数不同而分离。不同组分在两相中的分配系数不同而分离。不同组分在两相中的分配系数不同而分离。不同组分在两相中的分

18、配系数不同而分离。第11页/共135页第十二页，编辑于星期二：一点 十八分。（4 4 4 4）应用：）应用：）应用：）应用：二者相互补充二者相互补充二者相互补充二者相互补充 HPCEHPCEHPCEHPCE在在在在生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子分分分分离离离离方方方方面面面面，在在在在分分分分析析析析速速速速度度度度和和和和效效效效率率率率、样样样样品品品品和和和和试试试试剂剂剂剂用用用用量量量量方方方方面面面面有有有有优优优优势势势势，但但但但在在在在样样样样品品品品制制制制备备备备和和和和定定定定性、定量重复性等方面不及性、定量重复性等方面不及性、定量重复性等方面不及性、定量重复

19、性等方面不及HPLCHPLCHPLCHPLC。（3 3）仪器流程：）仪器流程：基本相同基本相同 都都包包括括进进样样装装置置、分分离离柱柱、检检测测器器和和数数据据记记录录处处理理等部分。等部分。第12页/共135页第十三页，编辑于星期二：一点 十八分。1.1.分离模式多：分离模式多：2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在3.1min内分离内分离36种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.1min内分离了内分离了24种阳离子；种阳离子；分离柱效：分离柱效：105107/m理论塔板数；理论塔板数；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少（进样量极少（纳升）纳升

20、），水介质中进行；，水介质中进行；4.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶5.5.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；小结：小结：高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点 （多、快、好、省多、快、好、省）第13页/共135页第十四页，编辑于星期二：一点 十八分。20.1 20.1 20.1 20.1 毛细管电泳的基本原理毛细管电泳的基本原理毛细管电泳的基本原

21、理毛细管电泳的基本原理一、一、电泳和电泳淌度电泳和电泳淌度二、二、电渗和电渗率电渗和电渗率三、表观淌度三、表观淌度四、四、分离效率和谱带展分离效率和谱带展宽宽五、五、分离度分离度第14页/共135页第十五页，编辑于星期二：一点 十八分。介质的介电常数介质的介电常数 介质的粘度介质的粘度 i粒子的 Zeta 电势,近似正比于 Z/M2/3 Z 为净电荷，M 为摩尔质量。电泳的速度电泳的速度 uep 可表示为：可表示为：ep 电泳淌度，电泳淌度，单位电场下的电泳速度。单位电场下的电泳速度。空心毛细管柱中一个粒子的空心毛细管柱中一个粒子的淌度淌度近似表示为：近似表示为：一一一一 、电泳和电泳淌度、电

22、泳和电泳淌度、电泳和电泳淌度、电泳和电泳淌度与介质性质有关与介质性质有关与粒子性质有关：与粒子性质有关：表面电荷和粒子质量的大小表面电荷和粒子质量的大小第15页/共135页第十六页，编辑于星期二：一点 十八分。有效淌度：有效淌度：在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶质分子在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的淌度称为的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的淌度称为有效有效淌度淌度。i 样品分子的第样品分子的第 i i 级电离度级电离度 i 活度系数或其它平衡离解度活度系数或其它平衡离解度总之，总之，粒子的迁移速度除与粒子的迁移速度除与电场强度电场强度和和介质

23、的特性介质的特性有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。不同的带电粒子电泳速度不同，可以实现分离不同的带电粒子电泳速度不同，可以实现分离第16页/共135页第十七页，编辑于星期二：一点 十八分。二、电渗和电渗率二、电渗和电渗率二、电渗和电渗率二、电渗和电渗率电电渗渗（electroosmotic）：在在电电场场作作用用下下，液液体体相相对对带带电电的的固固体体支支持持介介质质移移动动的的现现象象，又又称称电电渗渗（流流）EOF。第17页/共135页第十八页，编辑于星期二：一点 十八分。石英毛细管表面含有许多硅醇基（石英毛细管表面含

24、有许多硅醇基（SiOHSiOH），在一定的条件下可离解使表面带有负电荷。），在一定的条件下可离解使表面带有负电荷。毛细管中的电渗流的形成毛细管中的电渗流的形成双电层抗衡离子第18页/共135页第十九页，编辑于星期二：一点 十八分。机机理理：当当在在毛毛细细管管两两端端加加有有电电场场时时，双双电电层层内内靠靠近近管管壁壁的的稠稠密密层层中中可可迁迁移移阳阳离离子子向向阴阴极极移移动动。由由于于离离子子是是被被水水化化的的，因因此此，带带动动管管中中的的液液体体也随迁移着一起匀速向阴极移动，形成电渗流。也随迁移着一起匀速向阴极移动，形成电渗流。总之，总之，毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电荷毛细

25、管中的电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动。所引起的管内液体的整体流动。电电渗渗流流的的特特点点：具具有有一一定定流流型型，其其电电渗渗驱驱动动力力沿沿毛毛细细管管均均匀匀分分布布，所所以以电电渗渗速速度度的的径径向向分布几乎是均匀的。分布几乎是均匀的。第19页/共135页第二十页，编辑于星期二：一点 十八分。n n eoeo电渗率，电渗率，电渗率，电渗率，单位电场下的电渗流的线速度单位电场下的电渗流的线速度单位电场下的电渗流的线速度单位电场下的电渗流的线速度 介质的介电常数介质的介电常数 介质的粘度介质的粘度 管壁的管壁的 Zeta Zeta 电势，即电势，即双电层到双电层到

26、管壁很近的地方之间的电位差。管壁很近的地方之间的电位差。总总之之，Zeta Zeta 电电势势越越大大，介介电电常常数数越越大大，粘粘度度越越小小，电电渗渗流越大。流越大。在在电电场场作作用用下下，电电泳泳和和电电渗渗同同时时存存在在，电电渗渗流流速速度度是电泳的是电泳的 5 5 7 7 倍。倍。电渗的速度可以表示为：电渗的速度可以表示为：第20页/共135页第二十一页，编辑于星期二：一点 十八分。硅醇基阴离子石英毛细管柱内壁的双电层结构图石英毛细管柱内壁的双电层结构图双电层电势双电层电势表面电势表面电势 0Stern电势电势 d电动电势电动电势 双电层模型双电层模型第21页/共135页第二十

27、二页，编辑于星期二：一点 十八分。n n电渗流的控制：电渗流的控制：电渗流的控制：电渗流的控制：n n电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分离，有必要对它进行控制。离，有必要对它进行控制。离，有必要对它进行控制。离，有必要对它进行控制。n n电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进行调节。行调节。行调节。行调节。n n（1

28、1 1 1）电场强度）电场强度）电场强度）电场强度n n（2 2 2 2）缓冲溶液的）缓冲溶液的）缓冲溶液的）缓冲溶液的pHpHpHpH（影响管壁带电情况）（影响管壁带电情况）（影响管壁带电情况）（影响管壁带电情况）n n（3 3 3 3）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响Zeta Zeta Zeta Zeta 电势）电势）电势）电势）第22页/共135页第二十三页，编辑于星期二：一点 十八分。三、三、三、三、表观淌度表观淌度表观淌度表观淌度n n在在在在毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳中中中中

29、同同同同时时时时存存存存在在在在电电电电泳泳泳泳流流流流和和和和电电电电渗渗渗渗流流流流，所所所所以以以以带带带带电电电电粒粒粒粒子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表示为：子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表示为：子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表示为：子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表示为：uap 表观迁移速度表观迁移速度 ap 表观淌度表观淌度注：注：一般情况下一般情况下，uos os uefef第23页/共135页第二十四页，编辑于星期二：一点 十八分。中性分子中性分子 阳离子阳离子 阴离子阴离子电渗流电渗流第24页/共135页第二十五页，编辑于星期二：一点 十八分。

30、四、四、四、四、分离效率和谱带展宽分离效率和谱带展宽分离效率和谱带展宽分离效率和谱带展宽1.1.柱效参数柱效参数柱效参数柱效参数理论塔板数和塔板高度理论塔板数和塔板高度理论塔板数和塔板高度理论塔板数和塔板高度理论塔板数：理论塔板数：塔板高度：塔板高度：Ld 进样口到检测器之间的距离进样口到检测器之间的距离t tm m 迁移时间迁移时间，W W1/21/2 时间半峰宽时间半峰宽第25页/共135页第二十六页，编辑于星期二：一点 十八分。影响柱效的因素：影响柱效的因素：（1 1）n n 与与 E E 成正比，成正比，E E 越大，柱效越高。越大，柱效越高。（2 2）n n 与与溶溶质质的的扩扩散散

31、系系数数 （D）成成反反比比，D越越小小的的分分子柱效越高。子柱效越高。毛细管电泳的速率方程：毛细管电泳的速率方程：理论塔板数：理论塔板数：溶质的扩散系数溶质的扩散系数只有纵向扩散项只有纵向扩散项第26页/共135页第二十七页，编辑于星期二：一点 十八分。2.2.2.2.引起带展宽的因素引起带展宽的因素引起带展宽的因素引起带展宽的因素电渗的流型：电渗的流型：呈塞状扁平流型呈塞状扁平流型 扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因之扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因之一，是理想状态。一，是理想状态。第27页/共135页第二十八页，编辑于星期二：一点 十八分。（1 1）扩散）扩散扩扩散散系

32、系数数由由溶溶质质本本身身的的性性质质决决定定，随随分分子子量量的的增增加而降低。分子越大，加而降低。分子越大，D D 越小。越小。因此，毛细管电泳特别适合分离生物大分子。因此，毛细管电泳特别适合分离生物大分子。另外，凡是能影响溶质扩散的因素都会影响谱带宽度。另外，凡是能影响溶质扩散的因素都会影响谱带宽度。第28页/共135页第二十九页，编辑于星期二：一点 十八分。（2 2 2 2）自热（焦耳热）自热（焦耳热）自热（焦耳热）自热（焦耳热）n n焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，在毛在毛

33、在毛在毛细管内形成细管内形成细管内形成细管内形成径向温度梯度径向温度梯度径向温度梯度径向温度梯度（管壁温度（管壁温度（管壁温度（管壁温度 管轴心温度）管轴心温度）管轴心温度）管轴心温度）表：毛细管壁温度和中心到壁的温差表：毛细管壁温度和中心到壁的温差 径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度 ，引起电泳淌度改变，引起电泳淌度改变，导致离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，柱效降低。导致离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，柱效降低。第29页/共135页第三十页，编辑于星期二：一点 十八分。n n焦耳

34、热和温度梯度的控制焦耳热和温度梯度的控制n n焦焦焦焦耳耳耳耳热热热热的的的的大大大大小小小小与与与与毛毛毛毛细细细细管管管管尺尺尺尺寸寸寸寸、缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液电电电电导导导导及及及及电电电电场强度有关。场强度有关。场强度有关。场强度有关。n n操作电压：操作电压：操作电压：操作电压：电压越高，焦耳热越严重。电压越高，焦耳热越严重。电压越高，焦耳热越严重。电压越高，焦耳热越严重。n n柱内径：柱内径：柱内径：柱内径：是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，焦耳热的影响越小。通

35、常毛细管电泳采用尽可能小焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小的柱内径。的柱内径。的柱内径。的柱内径。n n缓冲溶液的浓度：缓冲溶液的浓度：缓冲溶液的浓度：缓冲溶液的浓度：浓度增加，焦耳热增加浓度增加，焦耳热增加浓度增加，焦耳热增加浓度增加，焦耳热增加。第30页/共135页第三十一页，编辑于星期二：一点 十八分。n n目前常采用内径为目前常采用内径为目前常采用内径为目前常采用内径为 2525252575 75 75 75 m m m m 的毛细管柱的毛细管柱的毛细管柱的毛细管柱n n采用外管壁涂层技术

36、采用外管壁涂层技术采用外管壁涂层技术采用外管壁涂层技术。Knox方程：方程：Edc1/31500E电场强度，电场强度，d d管内径，管内径，c c介质浓度介质浓度满足上式方程，自热影响较小。满足上式方程，自热影响较小。当当E=50kV/m,E=50kV/m,c c=0.01mol/L=0.01mol/L时，时，d140 m即能满即能满足上述方程足上述方程 。第31页/共135页第三十二页，编辑于星期二：一点 十八分。(3)(3)(3)(3)吸附吸附吸附吸附n n毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对毛细管电泳中的

37、吸附作用主要指毛细管管壁对被分离物质粒子的作用。被分离物质粒子的作用。被分离物质粒子的作用。被分离物质粒子的作用。n n主要原因：主要原因：主要原因：主要原因：n n阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。n n吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。n n内径越细，吸附越严重。内径越细，吸附越严重。内径越细，吸附越严重。内径越细，吸

38、附越严重。第32页/共135页第三十三页，编辑于星期二：一点 十八分。五、五、五、五、分离度分离度分离度分离度n n分离度：分离度：分离度：分离度：将淌度相近的组分分开的能力。将淌度相近的组分分开的能力。将淌度相近的组分分开的能力。将淌度相近的组分分开的能力。n 理论塔板数理论塔板数 u/u 两组分的相对迁移速度差两组分的相对迁移速度差定义式：定义式：根据根据 Gidding 方程，分辨率方程，分辨率 R 定义为：定义为：第33页/共135页第三十四页，编辑于星期二：一点 十八分。对上面的公式处理，可得：对上面的公式处理，可得：由公式可见：由公式可见：R 并非随操作电压线性增加，而是与并非随操

39、作电压线性增加，而是与操作电压的平方根成正比。操作电压的平方根成正比。操作电压的增加受到焦耳热的限制。操作电压的增加受到焦耳热的限制。第34页/共135页第三十五页，编辑于星期二：一点 十八分。20.2 20.2 20.2 20.2 毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式一、毛细管电泳的分类一、毛细管电泳的分类二、毛细管区带电泳法二、毛细管区带电泳法三、胶束电动毛细管色谱三、胶束电动毛细管色谱四、凝胶毛细管电泳法四、凝胶毛细管电泳法五、毛细管电色谱法五、毛细管电色谱法第35页/共135页第三十六页，编辑于星期二：一点 十八分。一、毛细管电泳的分类一、毛

40、细管电泳的分类一、毛细管电泳的分类一、毛细管电泳的分类按分离模式可分为三大类按分离模式可分为三大类电泳型电泳型毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳色谱型色谱型 毛细管电色谱毛细管电色谱胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱微乳液电动毛细管色谱微乳液电动毛细管色谱电泳电泳/色谱型色谱型第36页/共135页第三十七页，编辑于星期二：一点 十八分。二、二、二、二、毛细管区带电泳法毛细管区带电泳法毛细管区带电泳法毛细管区带电泳法（C C C Capillary Zone Electrophorsisapillary Zone Electrophor

41、sis,CZECZE）n n毛毛毛毛细细细细管管管管区区区区带带带带电电电电泳泳泳泳（又又又又称称称称毛毛毛毛细细细细管管管管自自自自由由由由溶溶溶溶液液液液区区区区带带带带电电电电泳泳泳泳法法法法）是是是是毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳中中中中最最最最简简简简单单单单、最最最最基基基基本本本本、使使使使用用用用最最最最广广广广泛泛泛泛的的的的一一一一种种种种技术。技术。技术。技术。n nCZECZE的理论的理论的理论的理论是其它是其它是其它是其它CECECECE方法的理论模板。方法的理论模板。方法的理论模板。方法的理论模板。第37页/共135页第三十八页，编辑于星期二：一点 十八分

42、。中性分子中性分子 阳离子阳离子 阴离子阴离子1.1.分离机理分离机理 在在只填充缓冲溶液只填充缓冲溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下因电场的作用下因淌度不同淌度不同而进行分离。而进行分离。第38页/共135页第三十九页，编辑于星期二：一点 十八分。在在毛毛细细管管中中，由由于于电电渗渗流流的的存存在在，所所有有溶溶质质都都随电渗流一起向负极迁移。随电渗流一起向负极迁移。在在CZECZE中中可可以以实实现现正正负负离离子子（或或粒粒子子）的的同同时时分分离离,中中性性粒粒子子随随电电渗渗流流一一起起流流出出毛毛细细管管,不不能能分分离离（图图谱

43、上是一个峰）谱上是一个峰）。组分的检出顺序为：组分的检出顺序为：阳离子（粒子）阳离子（粒子）中性粒子中性粒子负离子（粒子）负离子（粒子）CZE溶质的迁移规律小结：溶质的迁移规律小结：第39页/共135页第四十页，编辑于星期二：一点 十八分。n n2.2.2.2.影响影响影响影响CZECZECZECZE迁移速率的因素（操作条件的选择）迁移速率的因素（操作条件的选择）迁移速率的因素（操作条件的选择）迁移速率的因素（操作条件的选择）（1 1 1 1）操作电压）操作电压）操作电压）操作电压 操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度（离子操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度（离子操作电压与毛细管

44、的内径和长度及缓冲溶液浓度（离子操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度（离子强度）有关。强度）有关。强度）有关。强度）有关。n n柱柱柱柱长长长长一一一一定定定定时时时时，在在在在一一一一定定定定电电电电压压压压范范范范围围围围内内内内，操操操操作作作作电电电电压压压压与与与与粒粒粒粒子子子子的的的的迁迁迁迁移速度呈线性关系。移速度呈线性关系。移速度呈线性关系。移速度呈线性关系。n n当当当当电电电电压压压压过过过过高高高高时时时时，线线线线性性性性关关关关系系系系偏偏偏偏移移移移，主主主主要要要要是是是是由由由由高高高高电电电电压压压压引引引引起起起起的的的的焦焦焦焦耳耳耳耳热热热热造造

45、造造成成成成的的的的。电电电电压压压压的的的的极极极极值值值值范范范范围围围围随随随随系系系系统统统统和和和和组成而异。组成而异。组成而异。组成而异。一般为小于一般为小于一般为小于一般为小于30KV30KV30KV30KV。n n电压对柱效的影响也是相同的。电压对柱效的影响也是相同的。电压对柱效的影响也是相同的。电压对柱效的影响也是相同的。第40页/共135页第四十一页，编辑于星期二：一点 十八分。（2 2）缓冲溶液的选择：）缓冲溶液的选择：重要的分离因素重要的分离因素n nCZECZECZECZE缓冲溶液必须符合以下条件：缓冲溶液必须符合以下条件：缓冲溶液必须符合以下条件：缓冲溶液必须符合以

46、下条件：n n在规定的在规定的在规定的在规定的pHpHpHpH值范围内应有较强的缓冲能量，并值范围内应有较强的缓冲能量，并值范围内应有较强的缓冲能量，并值范围内应有较强的缓冲能量，并维持恒定的维持恒定的维持恒定的维持恒定的pHpHpHpH值。值。值。值。n n尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。冲盐。冲盐。冲盐。n n在检测波长处有较低的吸收度在检测波长处有较低的吸收度在检测波长处有较低的吸收度在检测波长处有较低的吸收度n n尽可能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都尽可

47、能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都尽可能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都尽可能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都小。小。第41页/共135页第四十二页，编辑于星期二：一点 十八分。缓冲溶液的缓冲溶液的pHpH：是影响组分离子淌度的最主要因素。是影响组分离子淌度的最主要因素。影响管壁电荷多少，影响电渗流的大小和迁移速率影响管壁电荷多少，影响电渗流的大小和迁移速率 ZetaZeta电位，电位，当当pHpH值在值在4 4 7 7时，对时，对EOFEOF影响最大影响最大 影响被分离物质的电荷，影响迁移速度和方向。影响被分离物质的电荷，影响迁移速度和方向。电离程度：如蛋白质，多肽等，电离程度：如蛋白质，多肽等，

48、荷电状况：荷电状况：第42页/共135页第四十三页，编辑于星期二：一点 十八分。当当当当pHpHpHpH pIpIpIpI,溶溶溶溶质质质质带带带带正正正正净净净净电电电电，朝朝朝朝阴阴阴阴极极极极泳泳泳泳动动动动，和和和和电电电电渗渗渗渗方方方方向向向向相同，粒子迁移总速度比电渗快；相同，粒子迁移总速度比电渗快；相同，粒子迁移总速度比电渗快；相同，粒子迁移总速度比电渗快；当当当当pH pH pH pH pIpIpIpI，溶溶溶溶质质质质带带带带负负负负净净净净电电电电，移移移移向向向向负负负负极极极极，和和和和电电电电渗渗渗渗方方方方向向向向相相相相反，粒子迁移总速度比电渗慢。反，粒子迁移总

49、速度比电渗慢。反，粒子迁移总速度比电渗慢。反，粒子迁移总速度比电渗慢。必须比必须比必须比必须比pIpIpIpI高或低一个高或低一个高或低一个高或低一个pHpHpHpH单位。单位。单位。单位。pIpIpIpI11 pH pH pH pH=pIpIpIpI，在在在在等等等等电电电电点点点点pIpIpIpI时时时时,正正正正负负负负解解解解离离离离相相相相等等等等，净净净净电电电电荷荷荷荷为为为为0 0 0 0；粒子迁移速度和电渗速度相同。粒子迁移速度和电渗速度相同。粒子迁移速度和电渗速度相同。粒子迁移速度和电渗速度相同。复习：蛋白质的等电点第43页/共135页第四十四页，编辑于星期二：一点 十八分

50、。多肽多肽编号编号计算的电荷计算的电荷计算的等电点计算的等电点pH=2.5pH=2.5pH=4.0pH=4.0pH=11.0pH=11.01 12.412.412.022.02-0.47-0.4710.510.52 21.411.411.021.02-0.71-0.7110.110.13 31.371.370.460.46-0.71-0.716.76.74 40.410.410.020.02-0.95-0.956.06.05 50.370.37-0.54-0.54-1.95-1.953.23.26 60.330.33-1.09-1.09-2.95-2.953.03.0表：表：6个合成小肽的计算