生物化学分析第1章生物大分子的分离纯化技术课件.ppt

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1、Biochemical Analysis 2015.32015.6）Biochemical Analysis 生化分析源于生命科学的蓬勃发展，是分析化学第三次变革（20世纪70年代）的产物，属于分析化学的分支。相对于分析化学（测量和表征物质的组成和结构的学科），生化分析主要侧重于：Bio-related,in situ(原位),in vivo(活体),real time(实时),non-destructive(无损),single molecular and single cell level analysis as well as techniques of characteristics

2、of biomoleculars.本课程涉及内容 生命活性物质（蛋白质、核酸、氨基酸、糖、酯等）的分析 利用生物化学技术（酶法、免疫、核酸杂交等）进行的分析 生物大分子的分离纯化技术（沉淀、膜、离心、层析、电泳等）Analytical techniques the key to life Science研究生命现象、了解生命本质和生命过程是现代自然科学发展过程中的基本问题之一。随着科技的不断发展，科学家们已开始着手从分子水平来研究生命过程，如：生命的本质是什么？从无生命如何产生生命，从细胞到整体生物，由生到死的生命过程中事件是如何发生？生命的起源和进化，进化的动因是什么？生物如何对环境中的有毒

3、有害物质作出应答？生物如何复制自身，如何传递信息等等。目前已对上述重要问题有了一定的认识（其中分析技术起到了关键性的作用），但远未解决，因此这将是今后重要的研究领域，分析化学将大有作为。21世纪生命科学领域的热点生命的基础物质研究：研究、发现新的生命活性物质；阐明大分子的高级组装结构遗传物质的作用：垃圾DNA（不编码蛋白质的DNA，约占基因组的0%）的作用；为什么人体蛋白质中的氨基酸都是L 构型，这与遗传物质间有什么关系？等等酶结构和酶催化功能的关系研究脑科学：神经细胞的信息传递功能及大脑的学习、记忆和思维功能等的研究从分子到细胞：无生命的分子是如何跨越一个鸿沟变成生物系统的（如细胞）？即分子

4、以上细胞以下这个层次的研究基因（蛋白质、金属、代谢物）组学的研究分析化学家面临的挑战授课内容及学时分布授课内容 学时 周次理论课32学时 生物大分子分离纯化技术 3 1 电泳 3 2 酶法分析 6 34 免疫分析 6 56 氨基酸、蛋白质分析 6 78 酯的分析和糖的分析 3 9 核酸分析和流动注射分析 5 1011实验课16学时 过氧化物酶的米氏常数测定 41114分组进行 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 4 酶联法测定血清中葡萄糖的含量 4 脱辅基血红蛋白的制备与重组 4考试方式及成绩评定期末考试 时间：第14周 方式：开卷 题型：选择、填空、计算、问答成绩评定 平时成绩（出勤）：10%实

5、验成绩：40%考试成绩：50%第1章 生物大分子的分离纯化技术（1）蛋白质、酶、核酸与多糖等生物大分子是生命现象的基本体现者，其结构与功能的研究，对于了解生命活动规律，阐明生命现象本质，指导工业生产和医药实践，以致整个自然科学都有着重大的理论和实践意义。生物大分子结构与功能的研究，是以能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，否则就无从谈起。随着生命科学飞速发展对各种专一的工具酶、基因载体质粒、基因片段等生物制品的需求，使得从各种来源的生物材料中分离、制备各种规格的大分子并采用高特性方法进行快速灵敏的测定成为一个非常迫切的要求。第1章 生物大分子的分离纯化技术（3）生物大分子分离纯化的的一

6、般步骤：u 确定目标生物大分子的用途，科研、开发还是要发现新的物质；建立相应且可靠的分析测定方法（关键）；w 通过文献调研和预备性实验，掌握目标生物大分子的物理化学性质；x 生物材料的破碎和预处理；y 分离纯化方案的选择和探索（最困难的过程）；z 生物大分子制备物均一性（即纯度）的鉴定。要求达到一维电泳一条带、二维电泳一个点或HPLC 和HPCE 都是一个峰；产物的浓缩，干燥和保存。2.生物大分子的分析测定方法可分为生物学和物理/化学测定方法u 生物学测定方法：酶的各种测活方法、免疫化学方法、蛋白质含量的各种测定法和放射性同位素示踪法等；物理/化学测定方法：比色法、光谱法（紫外/可见、红外和荧

7、光等分光光度法）、气相色谱和液相色谱法、电泳法、核磁共振及质谱法等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。4.生物材料的破碎和预处理（1）生物材料的选择：生物材料的来源可能是动物、植物和微生物及其代谢产物，选择时应注意以下几点：目标成分含量高、生物组织来源丰富、制备工艺简单、成本低。去除非活性部分，如动物组织要除去结缔组织、脂肪；植物要去壳、除脂；微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。尽可能保持新鲜，尽快加工处理。如暂不使用，应冰冻保存或深度冷冻保存（动物材料）。若所需成分在细胞内部，提取前需破碎细胞。4.生物材料的破碎和预处理（3）生物大分子的提取：提取条件应有利于增加

8、目标分子的溶解度并保持其生物活性，如：溶剂选择应遵循相似相容，酸碱性匹配；控制适当的温度；pH 远离目标分子等电点等。水溶液提取：稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。影响因素：盐浓度、pH 值、温度、抑制水解酶对目标分子的降解、温和搅拌、抑制巯基氧化。有机溶剂提取：和脂类结合较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水或稀的盐/酸/碱中，可加入一定比例可与与水互溶或部分互溶的有机溶剂提取，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。对于既能溶于稀酸/碱，又能溶于含一定比例有机溶剂的水溶液中蛋白质或酶，如胰岛素，采用稀有机溶液提取通常可防止水解酶的破坏，并兼有除去

9、杂质提高纯化效果的作用。5.分离纯化方法的选择（1）生物大分子分离纯化的主要原理根据分子的大小、形状、酸碱性、溶解度、极性、电荷及对其他分子亲和性等性质差异均可建立起相应的分离方法，但主要原理基本上可归纳为以下2个方面：利用各组分分配系数的差异，将其分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、结晶、层析等 通过物理力场的作用将处于同一物相中的各组分分配于不同的区域，如电泳、超速离心、超滤等关键技术：电泳、层析和离心（高速和超速）5.分离纯化方法的选择（3）前期分离纯化：特点：a.粗提取液中物质成份十分复杂；b.欲制备的生物大分子浓度很稀；c.物理化学性质相近的物质很多；d.希望能除去大部分与目

10、标产物物理化学性质差异大的杂质。对所选方法的要求：a.要快速、粗放；b.能较大地缩小体积；c.分辨力不必太高；d.负荷能力要大。可选用的方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸附、胖柱交换）；亲和层析等5.分离纯化方法的选择（4）后期分离纯化 可选用的方法：吸附层析、盐析、胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC 等。要注意的一些问题：a.盐析后要及时脱盐；b.凝胶过滤时需缩小上样体积（上样体积是柱床体积的1/101/6）；c.必要时可重复使用同一种分离纯化方法，如分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两次凝胶过滤、离子交换层析等；d.分离纯化

11、步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。如吸附应在盐析之前以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换应在凝胶过滤之前。e.分离纯化后期目标分子纯度和浓度都大大提高，很多敏感酶易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑且尽可能在低温下（如在冷室中）进行；f.得到最终产品后，必要时要立即冰冻干燥，分装并写明标签，-20 或-70 保存。7.分离纯化后产物的保存（1）生物大分子制成品的正确保存极为重要，保存不当将会使辛苦制成的产品失活、变性、变质，前期的全部制备工作化为乌有。影响生物大分子样品保存的主要因素有：u 空气：潮解、微生物污染和自动氧化。温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围。温度升

12、高10，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加13 倍。w 水分：自身所带或由空气中吸收的水可参与水解、酶解、水合和加合反应，加速氧化、聚合、离解和霉变。x 光线：通常都需避光保存。y 样品的pH：保存液态样品需正确选择缓冲剂的种类和浓度。z 时间：样品有不同有效期，保存时必须写明日期，定期检查和处理。7.分离纯化后产物的保存（2）u 低温下保存：通常要保存于-5-20（-70 保存最理想）。极少数酶可耐热，如核糖核酸酶可以短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl 中可耐受90；蔗糖酶在5060 可保持1530 min 不失活。制成干粉或结晶保存：固态的蛋白质和酶比其在溶液中要稳定的多，固态干粉制剂放在干燥剂中

13、可长期保存。w 在保护剂下保存：a.惰性生化或有机物质如糖类、脂肪酸、牛清白蛋白、氨基酸、多元醇等，可保持稳定的疏水环境。b.中性盐如MgSO4、NaCl、(NH4)SO4等。一些蛋白质需在高离子强度（14 mol/L 或饱和盐溶液）的极性环境中才能保持活性，但使用时需脱盐。c.巯基试剂：一些蛋白质和酶的表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中的氧缓慢氧化为磺酸或二硫化物而变性，保存时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。蛋白质和酶的保存为例第1章 生物大分子的分离纯化技术（4）常用分离纯化方法和技术u 沉淀法 膜分离法w 离心x 冷冻干燥y 色谱（层析）法z 电泳法（第二章介绍）1-1 沉淀法（2）生物大

14、分子制备中最常用的几种沉淀方法u 盐析法（中性盐沉淀）：用于各种蛋白质和酶的分离纯化。v 有机溶剂沉淀：用于蛋白质和酶、多糖、核酸及生物小分子的分离纯化w 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：用于除去某些不耐热的和在一定pH 值下易变性的杂蛋白。x 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。y 有机聚合物沉淀：主要使用聚乙二醇（PEG）作为沉淀剂，是发展较快的一种新方法。1-1-1 盐析（1）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等也都可以用盐析法进行沉淀分离。蛋白质分子的亲水基团（-

15、COOH、-NH2和-OH 等）与水分子的相互作用在蛋白质分子表面在水化膜。大量中性盐加入后（中性盐亲水性 蛋白质亲水性），蛋白质表面的水分子被夺走，水膜被破坏，既暴露出疏水区域，又中和了电荷，使得蛋白质分子相互聚集形成沉淀。1-1-1 盐析（2）盐析法的特点盐析过程可逆，析出蛋白的性质不易发生改变；根据不同蛋白盐析时的盐浓度不同，可通过盐浓度的改变实现分段盐析；方法简单且处理量大，既能去除杂质，又能浓缩溶液。选择性不高，适合生物大分析试样的粗制；盐析后需进行脱盐处理（透析或凝胶过滤）。1-1-1 盐析（4）盐析的操作方法将固体盐（硫酸铵最常用）研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计

16、划饱和度时，加盐速度要更慢，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要冰浴一段时间待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离；高浓度硫酸铵常用过滤方法。各种饱和度下需加的盐量可从手册中查到。1-1-1 盐析（5）盐析曲线的制作 若 所 需 分 离 蛋 白 质 或 酶 没 有 文 献 数 据 可 以 借 鉴，应 先 制 作 盐 析曲 线 以 确 定 沉 淀 该 物 质 的 硫 酸 铵 饱 和 度。即 依 次 改 变 硫 酸 铵 饱和 度，测 定 离 心 后 沉 淀 中 蛋 白 的 含 量 或 酶 活 力。以 硫 酸 铵 饱 和度 为 横 坐 标，沉 淀 中 蛋

17、 白 的 含 量 或 酶 活 力 为 纵 坐 标，即 可 得 盐析曲线。10 20 30 40 50 60 70 80 90 100蛋白质量或酶活力硫酸铵饱和度%1-1-2 有机溶剂沉淀法（2）有机溶剂沉淀法的特点分 辨 能 力 较 盐 析 法 高：即 一 种 蛋 白 质 或 其 他 溶 质 只 在 一 个 比 较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀沉 淀 不 用 脱 盐，过 滤 比 较 容 易（如 有 必 要，可 用 透 析 袋 脱 有 机溶剂），因而在生化制备中有广泛的应用对 某 些 具 有 生 物 活 性 的 大 分 子 容 易 引 起 变 性 失 活，操 作 需 在 低温下进行，沉淀后应尽快减少

18、有机试剂含量 沉淀分离常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等1-1-2 有机溶剂沉淀法（3）影响因素 温 度：多 数 生 物 大 分 子 在 有 机 溶 剂 中 对 温 度 特 别 敏 感，且 有 机 溶 剂 与水 混 合 时 产 生 放 热 反 应，因 此 操 作 要 在 冰 盐 浴 中 进 行，加 入 有 机 溶 剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。温度越低所得蛋白质活性越高 样 品 浓 度：低 浓 度 样 品 回 收 率 低，且 浪 费 有 机 溶 剂；高 浓 度 样 品 可 节省 有 机 溶 剂，减 少 变 性 的 危 险，但 杂 蛋 白 共 沉 淀 作 用 大。通 常 使 用52

19、0 mg/mL的蛋白质初浓度为宜 pH 值：通常选在等电点附近 离 子 强 度：少 量 中 性 盐 可 保 护 蛋 白 质 免 于 变 性，但 盐 浓 度 过 高 会 发 生盐溶效应，降低沉淀效果，通常盐浓度以不超过5为宜。1-1-3 选择性变性沉淀法利用目标与非目标生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定条件使杂蛋白等非目标物变性沉淀而得到分离提纯。u 热变性：利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目标生物大分子变性沉淀而保留目标物在溶液中。v 表面活性剂和有机溶剂变性：使对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀，通常在冰浴或冷室中进行。w 选择性酸碱变性：利用对pH

20、值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。1-1-4 等电点沉淀法氨基酸、蛋白质、酶和核酸等两性电解质在电中性时（此时的pH 值称为等电点）溶解度最低，易发生沉淀。藉此可实现等电点不同的两性电解质的分离。蛋白质的等电点十分接近，且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此单独使用此法分辨率较低，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。主要用于分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目标物。1-1-5 有机聚合物沉淀法有机聚合物是上世纪六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和

21、沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是：聚乙二醇PEG HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH,n4。PEG 的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量。生物大分子制备中用的较多的是分子量为600020000 的 PEG。本 方 法 的 优 点：a.操 作 条 件 温 和，不 易 引 起 生 物 大 分 子 变 性；b.沉 淀 效 能 高，很 少 量PEG 即 可 沉 淀 相 当 多 的 生 物 大 分 子；c.沉淀后有机聚合物容易去除。1-2 膜分离法（1）膜分离法的原理：以选择性透过膜为分离介质。当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位

22、差等）时，料液组分选择性的透过膜，从而达到分离、提纯的目的。显微镜下的膜1-2 膜分离法（2）膜分离的特点：u 操作在常温下进行；v 是物理过程，不需加入化学试剂；w 不发生相变化（因而能耗较低）；x 在很多情况下选择性较高；y 浓缩和纯化可在一个步骤内完成；z 设备易放大，可以分批或连续操作。广泛用于生物工程、食品、医药、化工等工业生产及水处理等各个领域。超滤工作示意图1-2 膜分离法（3）常见膜分离过程的类型膜过程 推动力 传递机理 透过物 截留物 膜类型微滤 压力差 颗粒大小形状 水和溶解物 悬浮物颗粒 纤维多孔膜超滤 压力差 分子大小形状 水和小分子 胶体和较大分子 非对称膜纳滤 压力

23、差 离子大小及电荷 水和无机离子 有机物 复合膜反渗透 压力差 溶剂的扩散传递 水 溶质、盐 非对成膜、复合膜透析 浓度差 溶质的扩散传递 小分子 大分子 非对称膜电渗析 电位差 离子的选择性传递 离子 中性物质及大分子 离子交换膜渗透蒸发压力差 选择性传递易渗溶质或溶剂难渗溶质或溶剂均相膜、复合膜、非对称膜微滤、超滤、纳滤和反渗透NF 介于UF 和RO之间，截留分子量大概在3001000透析（1）将待分离或纯化样品封入由半透膜组成的透析袋里，然后将袋子放入低离子强度的透析液中，此时袋内分子量小于透析袋截留分子量（molecular weight cutoff，MWCO；与半透膜规格相关，常见

24、的为10 000左右）的分子可通过膜进入透析液，从而实现大分子与小分子物质的分离。透析过程实现平衡约需46 h，因此常在4C 左右进行并需进行搅拌 透析的动力是扩散压（由膜两边的浓度梯度形成）。透析的速度反比于膜厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，膜面积和温度。透析（2）透析膜 透析膜材料通常为纤维素膜，此外还有火棉胶和玻璃纸，根据膜空径大小的不同有不同的规格（MWCO）。MWCO 是选择透析膜的主要指标，通常应使欲保留分子的分子量2倍与其上，而欲透出分子的分子量低于其的一半。透析膜的处理：把透析袋剪成适当长度的小段；在大体积含2%（w/v）碳酸氢钠和 1mmol L-1 p

25、H8.0 的EDTA 溶液中将透析袋煮沸10分钟；用蒸馏水（两次以上）彻底清洗透析袋；放在 1mmol L-1 pH8.0 EDTA 溶液中煮沸10分钟；冷却后存放于4C 环境中，且必须确保透析袋始终浸没在溶液内，从此时起取用透析袋是必须戴手套；用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。（也有即用型的）透析（3）透析液最常用的为一定pH 和离子强度的缓冲液（保持生物分子活性），但会造成透析液体积增大；也可以采用含高分子惰性物质的浓溶液，透析的同时还具有浓缩功能。勤换透析液或采用较大量透析液可加速透析过程（亦可抑制因donnan 效应所引起的pH 变化）。应用 大分子样品中去除盐类及其它小分子

26、（如有机溶剂等）；去除与大分子结合较弱的小分子或离子（透析液中加入适量螯合剂可加快该过程）；利用透析平衡可以测定大分子（蛋白质或核酸）与小分子间的结合常数。试样浓缩：可直接用吸收剂（聚乙二醇）吸收电渗析（1）利用离子交换膜的选择透过性进行工作。离子交换膜分为阳膜和阴膜。阳膜只允许阳离子通过而阴离子被阻挡；阴膜只充许阴离子通过而阳离子被阻挡。电渗析（2）蛋白质料液脱盐渗透蒸发（1）利用膜与被分离有机液体混合物中各组分的亲合力不同，而有选择性地优先吸附溶液某一组分，及各组分在膜中扩散速度不同，来达到分离的目的。不存在蒸馏法中的共沸点的限制，可连续分离、浓缩，直至得到纯有机物。分离过程：用渗透蒸发膜

27、将进料液相和透过气相隔开，在气相侧抽真空或通以惰性气流，把渗透组分的蒸气压控制到接近零，液相中产生的化学位梯度作为传质推动力的膜分离过程。渗透蒸发（2）乙醇的工业生产中渗透蒸发技术比传统共沸蒸馏节能60%几种主要膜分离技术特征1-2 膜分离法（4）常用膜材料 微滤膜材料：聚偏氟乙烯、聚丙烯、硝酸纤维、醋酸纤维 超滤膜：聚砜、硝酸纤维、醋酸纤维 反渗透膜：醋酸纤维素衍生物、聚醚、聚酰胺 天然材料：各种纤维素衍生物 人造材料：各种合成高聚物 特殊材料：复合膜、无机膜、不锈钢膜、陶瓷膜膜材料的基本要求：透过速度、选择性、机械强度、稳定性常用膜材料的特点 醋酸纤维膜：透过速度大；截留盐的能力强；易于制

28、备；来源丰富；不耐温（30）；pH 范围窄，清洗困难；与氯作用寿命降低；微生物侵袭；适合作反渗透膜 聚砜膜：温度范围广；pH 范围广；耐氯能力强；孔径范围宽；操作压力低；适合作超滤膜 聚酰胺膜：耐热；pH 范围广；寿命较长；不耐氯纤维素分子聚 砜芳香聚酰胺对成膜和不对称膜近年来开发的新型膜材料u 聚氨基葡糖v 在高分子材料中加入低分子液晶材料制成复合膜；w 无机多孔膜；x 功能高分子膜；y 纳米过滤膜。z 不锈钢膜 除此以外，改革膜体结构，加强“超薄膜”和“复合膜”的研究也是当前发展的新动向。1-2 膜分离（5）表征膜性能的参数有孔的特征、截断分子量、水通量、抗压能力、pH 适用范围、对热和溶

29、剂的稳定性等。制造商通常提供这些数据。截留率和截断分子量膜对溶质的截留能力以截留率R（rejection）来表示，其定义为R 1-CpCb（Cp和Cb分别表示在某一瞬间，透过液和截留液的浓度。若R=1，则Cp=0，表示溶质全部被截留；若R=0，则Cp=Cb，表示溶质能自由透过膜。对于超滤膜，制造商在出厂前通常用已知分子量的各种物质进行试验，测定其截留率。所得截留率与分子量之间的关系称为截断曲线，但到目前为止，对试验条件尚无统一规定。截断曲线质量好的膜，应有陡直的截断曲线，可使不同分子量的溶质分离完全；反之，斜坦的截断曲线会导致分离不完全。截留分子量MWCO 与膜孔径的关系MWCO（球状蛋白）近

30、似孔径（nm）1000 210 000 5100 000 121000 000 291-3 离心分离（1）原理：借助离心机高速旋转过程产生的离心力使液体介质中的样品粒子发生沉降。不同粒子的密度、大小和形状不同，因此在同一离心场中的沉降速度不同，藉此可实现相互分离。是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化和澄清方法。离心分离时，需根据欲分离物质及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。离心分离法分类离心方法 原理 转子类型 分离对象离心沉降 利用固液两相的相对密度差 无孔 悬浮液离心过滤 利用离心力并通过过滤介质 有空

31、悬浮液离心分离和超离心利用不同溶质颗粒在溶液各部分分布的差异无孔不同相对密度液体1-3 离心分离（2）离心分离的重要参数 离心力和相对离心力 沉降速度 沉降速率 沉降时间 K 系数离心力和相对离心力离心力：相对离心力：m：样品粒子的有效质量；：转子的角速度（rad/s）r:：平均离心半径（转子中心轴到粒子的距离/cm）n：转速/r min-1r：平均离心半径/cmRCF：所受离心力相当于地球引力的倍数，与样品无关。保持RCF 一致，同一样品可在不同离心机上获得相同的结果。离心实验报告中应给出RCF、转速和r平均、离心时间t 和液相介质等条件。RCF、n 和r 的关系 低速离心通常以转子每分钟的

32、转数表示（r/min），如4000 rpm。高速离心时，特别是超速离心时，往往用相对离心力来表示，如65000 g。根据左图可快速实现n、r 和RCF 的换算（利用公式也可实现）沉降速度沉降速度：在强大离心作用下，单位时间内样品粒子移动的距离。d：粒子的直径；：离心介质的粘度：密度；：转子的角速度；r：离心半径以球形颗粒为例沉降速度不仅取决于样品粒子所处离心力场的大小，还与样品粒子密度、大小和形状以及离心介质的密度和粘度有关。颗粒 介质 粒子顺着离心方向沉降；颗粒=介质 粒子处于平衡状态；颗粒 介质 粒子逆着离心方向上浮。沉降系数沉降系数：单位离心场中颗粒的沉降速度。单位S（Svedberg；

33、1S=10-13 s）r1和r2：t1和t2时粒子到转子中心轴的距离；n：转速 沉降系数与粒子密度、大小、形状和离心介质的密度及粘度有关。（20 水中的测量值为标准值）是生物大分子物质的特征常数。多数蛋白质和核酸的沉降系数为440 S，核糖体及其亚基为3080 S，多核糖体在100 S 以上。大分子化合物的详细结构和分子量不很清楚时，可用沉降系数描述其大小。分析型超速离心机可以很容易测定生物大分子的沉降系数。由沉降系数求分子量MrR：气体常数T：热力学温度S20,w：标准状态下粒子的沉降系数D20,w：标准状态下粒子的扩散系数：微分比容，等于粒子的密度倒数：溶剂密度不需要标准品，实验成本低；实

34、验操作较麻烦且受外界影响较大。沉降时间沉降时间：某种介质中，使样品粒子从液体的弯月面沉降到离心管某部（如底部）所需的时间。：悬浮介质的粘度；d：粒子直径；s：粒子密度；：介质密度；r1：旋转轴中心到液体弯月面的距离；r2：旋转轴中心到离心管底部的距离。当粒子直径或密度不同时，移动同样距离所需的时间不同；同理，相同的沉降时间，其沉降的位置也不同。K 系数K 系数：用来描述在一个转子中，粒子沉降到离心管底的效率。是表征转子离心沉降效率的特征参数，与转子几何结构和旋转速度有关。该值越小分离效率越高。rmax：旋转轴中心到离心管底部的距离rmin：旋转轴中心到液体弯月面的距离n：转速（r/min）通常

35、提供最高转速下的K 值，其他转速下K 值可自行转算K 值可用来估算离心时间沉降系数1-3 离心分离（3）离心机的类型及应用 制备离心机 分析离心机：属于超速离心机，具有光学观测系统nmax/r min-1RCFmax/g 特点 用途普通8 000 10 000转速和温度控制不精密固液沉淀分离高速25 000 100 000有控温装置；转速和温度控制精密菌体、细胞碎片、细胞器等的分离超速150 000 500 000有真空系统；时间、温度、转速控制精密细胞器分级分离；病毒、DNA、RNA、蛋白质分离提纯制备离心机的类型及应用分析性超速离心机（1）分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和

36、结构，而不是专门收集某一特定组份，因此它使用了特殊的转子和检测手段（光学系统）。依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和相对分子质量等。分析性超速离心机（2）应用 测定生物大分子的相对分子量；DNA 制剂、病毒和蛋白质等纯度的估计；单一清晰的沉降界面通常可认为是均质的，否则可认为存在杂质 分析生物大分子构象变化：构象改变会使沉降速度变化离心机转子的类型转子是离心技术的核心水平转子固定角转子近垂直转子垂直转子离心操作的注意事项 必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过离心机说明书上所规定的范围；转头中绝对不能装载单数管子，部

37、分装载时管子必须互相对称地放在转头中。v 离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。w 低于室温离心时，转头应放置在冰箱或离心机转头室内预冷。x 要根据离心机的具体操作说明，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管。y 离心过程中不得随意离开，如有异常声音应立即停机检查，及时排除故障。z 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，不得过速使用且需记录累积使用时间。离心时不准开盖，不准用手停止转头。1-3 离心分离（4）差速离心（高速）密度梯度离心（超速）等密度离心速率区带离心离心技术的分类沉淀离心（低速）差速离心法采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒在不同的离心速度及不同离心时间下

38、分批分离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。肝组织匀浆的差速分离按大小和密度分离细胞的组分。体积大，密度高的组分所受离心力大，移动快，首先到达离心管底部形成沉淀；体积较小，密度较低的组分仍保留在溶液中，称为上清液。密度梯度离心（1）密度区带离心法是样品在一定惰性密度梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。密度梯度系统：密度梯度介质有足够大的

39、溶解度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝集、变性或失活；样品铺在密度梯度溶液表面，离心后形成若干条界面清楚的不连续区带。密度梯度离心（2）优点：u 分离效果好，可一次获得较纯颗粒；v 适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定密度差的颗粒；w 颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点：离心时间较长；需要制备密度梯度；操作严格，不宜掌握。速率区带离心法（1）离心管内装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl 等，介质的最大密度必须小于样品中粒子的最小密度！）将待分离样品轻铺在密度梯度介质的液面上 进行离心并控制离心时间以免使粒子完全沉

40、降y 待分离粒子在密度梯度液中沉降速度不同，不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内，分离成一系列不连续区带。速率区带离心法（2）属于不完全沉降。离心时间过长，所有样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。因此离心过程中区带的位置、形状随离心时间而改变。速率区带离心法受物质粒子自身大小影响较大，而与其密度基本无关，因此适用于物质粒子大小相异而密度相似的情况，如RNA-DNA 混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离。大小相似而密度不同的粒子如线粒体、溶酶体和过氧物酶体则不能用此法分离。等密度离心法密度梯度区间必须包含被分离样品中所有粒子的密度。样品加入后由于不同颗粒存在浮力密度

41、差而在离心力的作用下向下沉降或向上浮起，一直沿梯度移动到与其密度恰好相等的位置（即等密度点）形成稳定的区带而实现分离。l 处于等密度点的颗粒没有重量，只要转速、温度不变，区带的位置、形状均不受离心时间的影响，体系处于动态平衡。即粒子形成纯组分的区带，只与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。l 等密度离心法适合大小相似而密度不同的粒子分离。离心时间对速率区带和等密度离心的影响速率区带离心法和等密度离心法的区别速率区带离心法 等密度离心法原理 依据粒子沉降速率的差异 依据粒子本身密度差异适用样本性质密度相近，分子量不同如蛋白质等分子量相近但密度不同如核酸、细胞器等梯度形成方式预先形成

42、（蔗糖、甘油）梯度较浅，密度较低离心时自动形成（CsCl）梯度陡峭，密度高梯度范围介质密度小于样品中各种粒子的密度介质的密度包含待分离样品中各种粒子的密度离心情况速度较低，不完全沉降，要在适当的时间停止离心完全沉降至于样品密度相同的位置，需高速，长时间高速与超高速离心法的比较密度梯度介质（1）作 用：a.增 加 分 离 层 次，提 高 分 辨 率；b.防 止 温 差 及 振 动造成的影响。基 本 要 求：a.梯 度 介 质 应 自 身 密 度 大 且 溶 解 度 足 够 大 以 便制 作 出 密 度 范 围 大 的 密 度 梯 度；b.理 化 性 质 稳 定，生 物 惰性，离 子 强 度 低，

43、渗 透 压 小，粘 度 小；c.具 某 种 可 测 性（如 折 射 率）以 测 其 浓 度（密 度）但 不 干 扰 分 离 组 分 的 测定；d.便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。常 用 介 质：a.盐 梯 度 介 质；b.小 分 子 有 机 物 如 蔗 糖；c.三碘化苯衍生物；d.有机高聚物；e.胶态二氧化硅常见的密度梯度材料及应用 蔗 糖：水 溶 性 大，性 质 稳 定，渗 透 压 较 高，其 最 高 密 度 可 达1.33 g/ml，且 价 格 低 易 制 备，是 实 验 室 里 常 用 于 细 胞 器、病 毒、RNA 分 离 的 梯度材料；但有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。

44、v 聚 蔗 糖：商 品 名Ficoll，常 采 用Ficoll-400（M=40 万）。Ficoll 渗 透 压低 但 粘 度 却 特 别 高，常 与 泛 影 葡 胺 混 合 使 用 以 降 低 粘 度。主 要 用 于 分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。w 氯 化 铯：离 子 性 介 质、水 溶 性 大，最 高 密 度 可 达1.91 g/ml。由 于 它 是重 金 属 盐 类，在 离 心 时 形 成 的 梯 度 有 较 好 的 分 辨 率，被 广 泛 地 用 于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。x 卤 化 盐 类：NaCl 梯 度 也 可 用 于 分 离

45、脂 蛋 白，NaI 梯 度 可 分 离 天 然 或 变性的DNA。y Percoll：商 品 名，是 外 层 包 裹 了 聚 乙 烯 吡 咯 酮 的SiO2胶 体。颗 粒 稳 定，渗 透 压 低，对 生 物 材 料 的 影 响 小；但 粘 度 高 且 在 酸 性pH 和 高 离 子 强 度下不稳定。可用于细胞、细胞器和病毒的分离。密度梯度介质（2）梯度的密度范围：差速区带离心：最大密度 组份最小密度等密度区带离心：最小密度 组份密度 最大密度 梯度的形状：线形（最常用）；凹形；凸形；阶梯形；复合型 密度梯度的制备：手工、梯度混合仪、离心形成法样品的收集 底部收集法（穿刺法）顶部收集法（取代法或

46、虹吸法）切割法：粘度大时可采用冷冻或聚合切割 穿刺法1-4 冷冻干燥（1）又称升华干燥，是在低温、负压下进行的干燥方法，样品中所有液态物质（水分和其他溶剂）几乎都可被挥发除去，剩余的大分子及无机盐形成疏松的固体，可长期的保存，是浓缩和干燥热敏性样品（酶、抗体等）的有效方法之一。样品装入冷冻干燥瓶中，在干冰-丙酮浴中凝结，然后与冷冻干燥器连接（-10-50 C；13 40 pa）一般适用于水体系，有机体系选择专门的冷冻干燥器。1-4 冷冻干燥（2）基本原理当温度在三相点O 以下，将压力降至OC线以下，溶剂（通常是水）就可以由固相直接升华为汽相。冰：40 上方蒸汽压为0.1mmHg 60 上方蒸汽

47、压为0.01mmHg1克0 的冰变成0 的蒸汽需吸热580千卡，容器外壁上会挂霜。冷冻干燥法的突出的优点：样品不起泡，不暴沸；得到的干粉样品不粘壁，易取出；冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。冷冻干燥的基本操作要求（1）u 样品溶液：a.不含有机溶剂，否则冰点降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油；b.样品要予脱盐，否则冰冻后易融化；c.样品缓冲液在冰冻时pH 可能会有较大变化需加入pH 稳定剂如糖类和钙离子等；d.溶液浓度不能过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL为宜。v 装样品溶液的容器：a.液层不要太厚，可根据需要选择各种尺寸器皿；b.冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状

48、固体样品，容易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否则会影响冻干速度。w 溶液冰冻：可用干冰-乙醇等低温浴速冻，边冻边旋转形成很薄的冰冻层，可大大加快冻干的速度。冷冻干燥的基本操作要求（2）x 冻干：a.样品全部冻干前不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末；b.若外霜消失则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延长冻干时间即可；c.冻干后要及时取出样品以免样品在室温下停留时间过长而失活；d.停真空泵时要先放气，以免泵油倒灌；放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉；e.样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮；f.真空泵要经常检查油面和油色，油面过

49、低和油色发黑，则需换油。1-5 色谱（层析）法液相色谱法是目前对生物大分子的分离纯化能力最强、效率最高、适用最广泛的手段之一。最常用的几种液相色谱法 空间排阻色谱（尺寸/形状）亲和色谱（生物特异性）离子交换色谱（电荷）疏水作用色谱（疏水性）1-5-1 空间排阻色谱（1）原理：以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而实现按分子量大小分离，又称凝胶色谱。受限于固定相孔径，大分子不能或不易进入固定相内部，通过色谱柱时所走的途径短，故较先流出；小分子易扩散到固定相内部，通过色谱柱时所走的途径长，故较后流出。1-5-1 空间排阻色谱（2）分类 凝胶过滤色谱（GFC）：采用亲水性固定相，以水

50、或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱（GPC）：采用疏水性固定相，以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子。GPC 主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。1-5-1 空间排阻色谱（3）GFC 对固定相的基本要求 亲 水 性 高；表 面 惰 性，不 发 生 化 学 和 物 理 变 化；高 稳 定性，有 较 宽 的pH 和I 适 应 范 围；具 有 一 定 的 孔 径 分 布；机 械强度高，耐高压操作，寿命长GFC 常用凝胶类型 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶 二乙烯基苯型凝胶 多孔玻璃凝