核酸的性质及研究方法学习教案.pptx

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1、会计学 1核酸(hsun)的性质及研究方法第一页，共58页。鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。含量(hnling)计算1A260（OD260）值相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸 判断DNA是否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）核酸(hsun)紫外吸收光谱的应用第1页/共57页第二页，共58页。二 核酸(h sun)的变性DNA

2、的变性(binxng)过程部分双螺旋解开(ji ki)无规则线团 链内碱基配对核酸的变性是指核酸受到加热、极端的pH或离子强度的降低等因素或特殊的化学试剂的作用，其双螺旋区的氢键断裂，变成单链的过程，其中并不涉及共价键断裂。第2页/共57页第三页，共58页。变性因素：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸(ynsun)胍、甲醛）变性后的理化性质：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。第3页/共57页第四页，共58页。增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大(znd)减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。DN

3、A的变性是爆发式的，变性作用发生(fshng)在一个很窄的温度范围内。第4页/共57页第五页，共58页。1 Tm：熔解(rn ji)温度（melting temperature）Polyd(A-T)DNA Polyd(G-C)DNA的变性发生在一 个 很 窄 的 温 度(wnd)范围内，通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度(wnd)称为该DNA的 熔 解 温 度(wnd)，用Tm表示。某些DNA的Tm值60 80 1001.01.41.2100%A260t0CTm Tm Tm12 3123第5页/共57页第六页，共58页。熔解温度（Tm）浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1

4、.00，完全变性(binxng)（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在8295 之间第6页/共57页第七页，共58页。2 影响(yngxing)DNA的Tm值的因素DNA均一性。均一性高，变性的温度范围(fnwi)越窄，据此可分析DNA的均一性。第7页/共57页第八页，共58页。G-C含量与Tm值成正比。测定(cdng)Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44第8页/共57页第九页，共58页。介质(jizh)中离子强度离子强度高，Tm高。第9页/共57页第十页，共58页。三 核酸(h sun)的复性

5、在一定条件下，变性DNA单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色(jins)效应）,DNA的功能恢复。第10页/共57页第十一页，共58页。DNA的复性(fxn)历程第11页/共57页第十二页，共58页。热变性DNA在缓慢(hunmn)冷却时可以复性，快速冷却不能复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量。第12页/共57页第十三页，共58页。Cot 是Co 与 t 的乘积，Co 为变性DNA（复性前）的原始(yunsh)浓度，以摩尔浓度（mol/L）表示，t为复性时间，以秒（s）表示。复性分数 f=1/1+kCot Cot 是指复性完成一

6、半时的Cot值。第13页/共57页第十四页，共58页。根据复性动力学可以(ky)测定基因组的大小和重复序列的拷贝数第14页/共57页第十五页，共58页。分子(fnz)杂交不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸(hsun)分子杂交（hybridization）制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例：southern印迹法第15页/共57页第十六页，共58页。分子杂交(zjio)的原理示意图第16页/共57页第十七页，共58页。Southern印迹(yn j)法限制(xinzh)片段限制性酶切割(qi

7、g)琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜第17页/共57页第十八页，共58页。四 核酸(h sun)的水解 酸水解(shuji)碱水解(shuji)酶水解(shuji)第18页/共57页第十九页，共58页。核酸(h sun)的酶水解 核酸酶的分类(fn li)（11）根据）根据(gnj)(gnj)对对底物的底物的 专一性分为专一性分为（2）根据切割位点分为核糖核酸酶(RNase)脱氧核糖核酸酶(DNase)非特异性核酸酶核酸内切酶核酸外切酶第19页/共57页第二十页，共58页。内切核酸酶对RNA的水

8、解(shuji)位点示意图5p p p pOHPy Pu Py Py1p p pG A C Up p pG A3RNAaseIRNAaseIRNAaseT1RNAaseT1Pu：嘌呤(piolng)Py：嘧啶第20页/共57页第二十一页，共58页。限制性内切酶 原核生物中存在着一类能识别外源原核生物中存在着一类能识别外源DNADNA双螺旋中双螺旋中4-84-8个碱基对个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解某位点水解DNADNA双螺旋链，产生粘性双螺旋链，产生粘性(zhn xn)(zhn xn)末端或平末

9、端，末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonucleaseristriction endonuclease）。）。第21页/共57页第二十二页，共58页。第22页/共57页第二十三页，共58页。限制性内切酶的命名(mng mng)和意义EcoRI序号属名属名种名 株名株名例：例：EcoRI EcoRI，这是从大肠杆菌（，这是从大肠杆菌（Ecoli Ecoli）R R菌珠中分离 菌珠中分离(fnl)(fnl)出的一种限制性内切酶 出的一种限制性内切酶限制酶的命名：E.coRI第一位：属名E（大写）第二、三位：种名的头两个字母小写(xioxi

10、)co第四位：菌株R第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号第23页/共57页第二十四页，共58页。限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细(xinx)的DNA分子。第24页/共57页第二十五页，共58页。外切(wi qi)核酸酶对核酸的水解位点5p p p pOHBp p pp3B BBBBBB牛脾磷酸二酯酶（5 端外切(wiqi)5 得3）蛇毒(shd)磷酸二酯酶（3 端外切3 得5）非专一性核酸酶类可作用于RNA或DNA第25页/共57页第二十六页，共58页。第二节 核酸研究(yn

11、ji)的技术和方法一 DNA的化学合成：合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护(boh)。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护(boh)第26页/共57页第二十七页，共58页。二 核酸的分离、纯化(chn hu)和定量尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈(jli)搅拌。抑制核酸酶。第27页/共57页第二十八页，共58页。真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl），据此，采用高盐提取(tq)，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取(t

12、q)出DNP。DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀 DNA分离(fnl)纯化第28页/共57页第二十九页，共58页。不同(btn)构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同(btn)，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同(btn)构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。核酸(hsun)的离心分离纯化第29页/共57页第三十页，共58页。紫外分光(fnun)光度法(A260)定磷法（DNA含磷9.2%，RNA含磷9.0%）定糖法（DNA；二苯胺法，RNA；苔黑酚法）核酸(h sun)

13、的定量 第30页/共57页第三十一页，共58页。核酸(h sun)的纯度 鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚(bn fn)，则A260/A280比值明显降低。第31页/共57页第三十二页，共58页。三 DNA一级结构(jigu)的测定n n 末端终止法 末端终止法n n 化学断裂法 化学断裂法n n 焦磷酸测序 焦磷酸测序 n n 前两种方法一般都会用放射性 前两种方法一般都会用放射性32P 32P对 对DNA DNA进行标记，需要 进行标记，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的核酸片段

14、进行 使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的核酸片段进行分离 分离(fnl)(fnl)，分离，分离(fnl)(fnl)以后还需要使用放射自显影的技 以后还需要使用放射自显影的技术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同 术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同位素对 位素对DNA DNA进行标记。焦磷酸测序是新一代 进行标记。焦磷酸测序是新一代DNA DNA序列分析 序列分析技术，该项技术无需电泳，技术，该项技术无需电泳，DNA DNA片段也无须荧光标记，操 片段也无须荧光标记，操作极为简便。作极为简便。第32页/共57页第三十三页，共58页。(一)末端(m dun)终

15、止法 又称双脱氧终止法英国(yn u)Sanger1955确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。第33页/共57页第三十四页，共58页。DNA DNA是一种双螺旋分子，其复制是在 是一种双螺旋分子，其复制是在DNA DNA聚合酶催化下，以原来的 聚合酶催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新 两条母链上的核苷酸序列为模板，通过互补配对的方式合成新DNA DNA链的过程。复制需要引物和四种 链的过程。复制需要引物和四种dNTPs dNTPs，总是从，总是从5-5-端

16、向 端向3-3-端进行。细 端进行。细胞内 胞内DNA DNA复制的引物一般是 复制的引物一般是RNA RNA，但体外，但体外DNA DNA复制的引物可以是人 复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物 工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3-3-端 端自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断 自由的羟基，依据碱基互补配对的原则，不断(bdun)(bdun)地形成新的 地形成新的3,5-3,5-磷酸二酯键，使 磷酸二酯键，使DNA DNA链得到延伸，直到一个新的 链得到延伸，直到一个新的DNA DNA分子完全 分子完全被合成。被合成。第34页

17、/共57页第三十五页，共58页。第35页/共57页第三十六页，共58页。第36页/共57页第三十七页，共58页。第37页/共57页第三十八页，共58页。图13-10末端(mdun)终止法测定DNA一级结构的原理和步骤第38页/共57页第三十九页，共58页。末端(m dun)终止法?进行四组平行反应进行四组平行反应?每一组反应混合物含有每一组反应混合物含有dATP,dGTP,dCTPdATP,dGTP,dCTP和和dTTPdTTP，有一种被有一种被32P32P标记标记?每一组反应含有一种少量的每一组反应含有一种少量的ddATPddATP或或ddGTPddGTP或或ddCTPddCTP或或ddTT

18、PddTTP。?在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNADNA合合成正常延伸。成正常延伸。?有时，聚合酶使用有时，聚合酶使用ddNTPddNTP，而导致末端终止。，而导致末端终止。?每一组反应中每一组反应中ddNTPddNTP的随机插入留下一系列长度的随机插入留下一系列长度(chngd)(chngd)不等的以该双脱氧核苷酸结尾的不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNADNA链。链。?对每一组反应混合物走凝胶电泳。对每一组反应混合物走凝胶电泳。?片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。?从凝胶的底部向上读出序列。从凝胶的

19、底部向上读出序列。?将读出的序列转化成互补链的序列。将读出的序列转化成互补链的序列。第39页/共57页第四十页，共58页。（二）化学断裂法 Maxam-Gilbert，1977原理：利用特异性的化学裂解法，制备(zhbi)出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经侧序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG第40页/共57页第四十一页，共58页。化学(huxu)断裂法n n 进行四组平行的反应：进行四组平行的反应：

20、n n G G特异性剪切 特异性剪切 在碱性 在碱性(ji(ji n xn n xn)条件下，先用 条件下，先用硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS DMS）处理，然后再使用哌啶处理。）处理，然后再使用哌啶处理。n n 嘌呤碱基特异性剪切 嘌呤碱基特异性剪切DNA DNA先进行酸处理，然后 先进行酸处理，然后再加 再加DMS DMS。n n 嘧啶碱基特异性剪切 嘧啶碱基特异性剪切 先用肼处理，然后用哌啶 先用肼处理，然后用哌啶处理。处理。n n C C特异性剪切 特异性剪切 在高盐浓度下，先用肼处理，然 在高盐浓度下，先用肼处理，然后用哌啶处理。后用哌啶处理。n n 即进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自

21、显影。比较 即进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G G、A A G G、C C T T和 和C C各个泳道，自下而上从自显影片上 各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出 就可读出DNA DNA序列。序列。第41页/共57页第四十二页，共58页。第42页/共57页第四十三页，共58页。(三)焦磷酸测序n n焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由44种特异性酶种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种加入一种dNTPdNTP，若该，若该dNTPdNTP与模板配对与模板配对(pi du)(pi

22、 du)，聚合，聚合酶就可以将其掺入到引物链的酶就可以将其掺入到引物链的3-3-端并释放出等量的焦端并释放出等量的焦磷酸基团（磷酸基团（PPiPPi）。）。PPiPPi可转化为可见光信号，并最终转可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种dNTPdNTP，继续下一轮，继续下一轮DNADNA链的合成。链的合成。第43页/共57页第四十四页，共58页。第44页/共57页第四十五页，共58页。DNA自动(zdng)分析仪的组成第45页/

23、共57页第四十六页，共58页。四 RNA一级结构(jigu)的测定n n目前用来测定目前用来测定RNARNA一级结构的方法主要有：一级结构的方法主要有：n n（11）先使用逆转录酶将待测）先使用逆转录酶将待测RNARNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA，然后再，然后再 n n 使用使用SangerSanger的末端终止法进行测定；的末端终止法进行测定；n n（22）用化学或）用化学或/和酶学方法对放射性同位素标记的和酶学方法对放射性同位素标记的RNARNA进进n n 行部分行部分(b fen)(b fen)消化后，再进行聚丙烯酰胺电泳分消化后，再进行聚丙烯酰胺电泳分析；析；n n（33）质谱法

24、）质谱法第46页/共57页第四十七页，共58页。一 核酸与遗传信息的传递(chund)和表达（一）DNA是基本遗传物质1944，O.Avery 肺炎双球菌转化实验(shyn)1952，A.D Hershey 和M.Chase 噬菌体感染实验(shyn)第三节 核酸(h sun)的生物学功能和实践意义第47页/共57页第四十八页，共58页。遗 传 密 码遗传密码:DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋 白 质 中 氨 基 酸 序 列 之 间 的 对 应 关 系(gunx)称为 遗传密码。密码子(codon)：mRNA 上每3 个相邻的核苷酸编码 蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个 核苷酸就称为一

25、个密码子或三联体密码。第48页/共57页第四十九页，共58页。遗传密码(m m)字典UACGUCAGU CAG第二位第一位（5）第三位（3）UCAGUCAGUCAG1965 年编写出遗传(ychun)密码表，密码子的阅读方向53第49页/共57页第五十页，共58页。（二）RNA 功能(gngnng)1 参与蛋白质的合成 2 RNA的转录后加工(ji gng)与修饰3 参与基因表达的调控4 生物催化作用第50页/共57页第五十一页，共58页。（三）遗传信息传递(chund)的 中心法则DNA:ATGCATGCATGCRNA:AUGCAUGCAUGCPROTEIN:aa1aa2aa3aa4转录(z

26、hunl)翻译(fny)第51页/共57页第五十二页，共58页。遗传信息传递(chund)的 中心法则蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个(lin)子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RN

27、A病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示(jish)遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。第52页/共57页第五十三页，共58页。（二）核酸(h sun)与病毒噬菌体T2结构(jigu)头部颈圈尾部基板尾丝尖钉第53页/共57页第五十四页，共58页。动物病毒(bngd)切面模式图被膜（脂蛋白、碳水化合物）衣壳（蛋白质）突起(tq)（糖蛋白）病毒(bngd)粒（DNA或RNA）核酸第54页/共57页

28、第五十五页，共58页。乙肝病毒艾滋病毒第55页/共57页第五十六页，共58页。三 人类基因组计划(jhu)简介（Human Genome Project，HGP）该计划是美国科学家在1985年率先提出，1990年正式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作，1999年我国成为HGP的第六个成员国。HGP旨在阐明人类基因组DNA所具有的3109核苷酸的序列，发现所有(suyu)的人类基因并阐明其在染色体上的位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面地认识自我。到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的工作已完成。HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。第56页/共57页第五十七页，共58页。感谢您的观看(gunkn)。第57页/共57页第五十八页，共58页。