核酸B学习教案.pptx

《核酸B学习教案.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸B学习教案.pptx（45页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、会计学 1核酸(hsun)B第一页，共45 页。2、RNAase牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease)RNaseI或RNaseA最适pH：7.0-8.2产物：3-嘧啶核苷酸或3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶RNaseT1耐热(nair)、耐酸产物：3-鸟苷酸或3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高第1 页/共44 页第二页，共45 页。内切核酸酶对RNA的水解(shuji)位点示意图5p p p p OHPy Pu Py Py1p p pG A C Up p pG A3RNAaseIRNAaseIRNAaseT1RNAaseT1Pu：嘌呤(piolng)Py

2、：嘧啶第2 页/共44 页第三页，共45 页。3、DNase牛胰脱氧核糖核酸酶，DNaseI无碱基专一性，切断(qidun)双链或单链DNA产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸，最适pH78牛脾脱氧核糖核酸酶，DNase 无碱基专一性,产物：以3-磷酸为末端的寡核苷酸,最适pH45DNA限制性内切酶第3 页/共44 页第四页，共45 页。外切(wi qi)核酸酶对核酸的水解位点5p p p pOHBp p pp3BB BBB B B牛脾磷酸二酯酶（5 端外切(wiqi)5 得3）蛇毒(shd)磷酸二酯酶（3 端外切3 得5）4 非专一性核酸酶类可作用于RNA 或 DNA第4 页/共44 页第五页，

3、共45 页。二 核酸(h sun)的紫外吸收1天然(tinrn)DNA2变性DNA3核苷酸总吸收值220 240 260 2800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123DNA的紫外吸收光谱(x shu un p)最大吸收峰为260 nm第5 页/共44 页第六页，共45 页。三 核酸的变性(binxng)、复性及杂交（一）变性(binxng)DNA的变性(binxng)过程部分(b fen)双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加（增色效应）,DNA的功能丧失。第6 页/共44 页第七页，共4

4、5 页。变性因素：热变性 酸碱变性（pH 小于4 或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性后的理化性质：260nm 吸收值升高。粘度降低(jingd)，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。第7 页/共44 页第八页，共45 页。增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性(binxng)过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。DNA 的变性是爆发式的，变性作用(zuyng)发生在一个很 窄的温度范围内。第8 页/共44 页第九页，共45 页。1 Tm：熔解(rn ji)温度（melting temperature）Polyd(A-T)DNA Polyd(G

5、-C)DNA的变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为 该 DNA的 熔 解(rn ji)温度，用Tm表示。某些DNA的Tm值60 80 1001.01.41.2100%A260t0CTm Tm Tm12 312 3第9 页/共44 页第十页，共45 页。熔解温度（Tm）浓度50ug/mL时，双链DNAA260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大(znd)值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在8295 之间第10 页/共44 页第十一页，共45 页。2、影响(yngxing)DNA的Tm值的

6、因素DNA均一性。均一性高，变性的温度(wnd)范围越窄，据此可分析DNA的均一性。第11 页/共44 页第十二页，共45 页。G-C含量与Tm值成正比。测定(cdng)Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44第12 页/共44 页第十三页，共45 页。介质中离子(lz)强度离子(lz)强度高，Tm高。第13 页/共44 页第十四页，共45 页。（二）复性(f xn)在一定条件(tiojin)下，变性DNA单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的功能恢复。第14 页/共44 页第十五页，共45 页。热变性DNA 在缓慢冷却时可 以复性，快速(

7、kuis)冷却不能复性。DNA 片段越大，复性越慢；DNA 浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot 衡量。第15 页/共44 页第十六页，共45 页。Cot 是Co 与 t 的乘积，Co 为变性DNA（复性前）的原始(yunsh)浓度，以摩尔浓度（mol/L）表示，t为复性时间，以秒（s）表示。复性分数 f=1/1+kCot Cot 是指复性完成一半时的Cot值。第16 页/共44 页第十七页，共45 页。不同DNA 的复性(fxn)动力学曲线。第17 页/共44 页第十八页，共45 页。（三）分子(fnz)杂交第18 页/共44 页第十九页，共45 页。分子(fnz)杂交的原理示意图不同来源

8、的DNA单链间或单链 DNA与 RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分 子 杂 交（hybridization）制备(zhbi)特 定 的 探 针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定 位 研 究。实 例：southern印迹法第19 页/共44 页第二十页，共45 页。Southern印迹(yn j)法限制(xinzh)片段限制性酶切割(qig)琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜第20 页/共44 页第二十一页，共45 页。四 核酸的沉降(chnjing)特

9、性与超速离心沉降系数（S）生 物 大 分 子 在 单 位(dnwi)离 心 力 场 作 用 下 的 沉 降 速 度称 为 沉 降 系 数。即 沉 降 系 数 是 微 颗 粒 在 离 心 力 场 的 作 用下，从 静 止 状 态 到 达 极 限 速 度 所 需 要 的 时 间。其 单 位(dnwi)用Svedberg，即s 表示，s=110-13 秒。沉降系数（S）与分子量（M）的关系(gun x)M=RTsD(1-)Svederg方程:第21 页/共44 页第二十二页，共45 页。不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl 密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA

10、与蛋白质区分开来这一方法常用(chnyn)于质粒DNA 的纯化。第22 页/共44 页第二十三页，共45 页。第四节 核酸(h sun)的分离，合成，鉴定和序列测定 一 分离，纯化和定量尽 可 能 保 持 其 天 然 状 态，防 止(fngzh)降 解 和 变性。条件温和，防止(fngzh)过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。第23 页/共44 页第二十四页，共45 页。真核DNA以核蛋白（DNP）形式(xngsh)存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNP

11、可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀 DNA分离(fnl)纯化第24 页/共44 页第二十五页，共45 页。紫外分光(fnun)光度法(A260)定磷法（DNA含磷9.2%，RNA含磷9.0%）定糖法（DNA；二苯胺法，RNA；苔黑酚法）（三）核酸(h sun)的定量 第25 页/共44 页第二十六页，共45 页。二 DNA的化学合成：合成(hchng)方向：35端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护第26 页/共44 页第二十七页，共45 页。三 一级结构(ji

12、gu)的测定（1）双脱氧终止法英国Sanger1955 确 定 牛 胰 岛 素 结 构(jigu)，1958 获 诺 贝 尔 化学奖1975 设计出DNA 测序法，1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA 序列互补的DNA 片段群。第27 页/共44 页第二十八页，共45 页。第28 页/共44 页第二十九页，共45 页。第29 页/共44 页第三十页，共45 页。第30 页/共44 页第三十一页，共45 页。MOV:MCB4.0DideoxysequencingofDNA第31 页/共44 页第三十二页，共45 页。第32 页/共44 页第三十三页，共45 页。（2）化学裂解法Maxam

13、-Gilbert，1977原理：利 用 特 异 性 的 化 学 裂 解 法，制 备 出 长 度 只 差 一 个 核苷 酸 的 片 段(pin dun)群，然 后 将 此 片 段(pindun)群经侧序胶电泳和放射自显影得到侧序图谱。32P-GCTACGTA：在A 处：32P-GCT 和32P-GCTACGT在G 处：32p，32p-GCTAC在C 处：32P-G 和32P-GCTA在T 处：32P-GC 和32P-GCTACG第33 页/共44 页第三十四页，共45 页。第五节 核酸(h sun)的生物学功能和实践意义 一 核酸(h sun)与遗传信息的传递和表达（一）DNA是基本遗传物质19

14、44，O.Avery 肺炎双球菌转化(zhunhu)实验1952，A.D Hershey 和M.Chase 噬菌体感染实验第34 页/共44 页第三十五页，共45 页。遗 传 密 码遗 传 密 码:DNA（或mRNA）中 的 核 苷 酸序列与蛋 白 质 中 氨 基 酸 序 列 之 间 的 对 应 关 系(gunx)称 为遗传密码。密 码 子(codon)：mRNA 上 每3 个 相 邻 的 核苷酸编 码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或 三联体密码。第35 页/共44 页第三十六页，共45 页。遗传密码(m m)字典UACGUCAGU C A G第二位第一位（5）第三位

15、（3）UCAGUCAGUCAG第36 页/共44 页第三十七页，共45 页。遗传密码(m m)的性质1、密码是无标点符号的且相邻密码子互不重叠(chngdi)。2、密码的简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并性（dogeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子(Synonymouscodon)。密码的简并性可以减少有害突变。3、密码的摆动性（变偶性）：密码的专一性主要是由第一第二个碱基所决定，tRNA上的反密码子与mRNA密码子配对时，密码子的第一、二位碱基是严格的，第三位碱基可以有一定的变动。Crick称这一为变偶性（wobble）.4、密码的通用性和变异性5、

16、64组密码子中，AUG既是的Met密码，又是起始密码；有三组密码不编码任何氨基酸，而是多肽链合成的终止密码子：UAG、UAA、UGA。第37 页/共44 页第三十八页，共45 页。（二）RNA 功能(gngnng)1、参与蛋白质的合成 2、RNA 的转录(zhun l)后加工与修饰3、参与基因表达的调控4、生物催化作用第38 页/共44 页第三十九页，共45 页。二 核酸(h sun)与病变（一）核酸(h sun)与遗传疾病第39 页/共44 页第四十页，共45 页。（二）核酸(h sun)与病毒噬菌体T2结构(jigu)头部颈圈尾部基板尾丝尖钉第40 页/共44 页第四十一页，共45 页。动

17、物病毒(bngd)切面模式图被膜（脂蛋白、碳水化合物）衣壳（蛋白质）突起(tq)（糖蛋白）病毒(bngd)粒（DNA或RNA）核酸第41 页/共44 页第四十二页，共45 页。乙肝病毒艾滋病毒第42 页/共44 页第四十三页，共45 页。三 人类基因组计划(jhu)简介（Human Genome Project，HGP）该计划是美国科学家在1985年率先提出，1990年正式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作，1999年我国成为HGP的第六个成员国。HGP旨在阐明人类基因组DNA所具有的3109核苷酸的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面地认识自我(zw)。到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的工作已基本完成。HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。第43 页/共44 页第四十四页，共45 页。感谢您的观看(gunkn)。第44 页/共44 页第四十五页，共45 页。