生化21常用分子生物学技术原理与应用课件.ppt

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1、第二十一章第二十一章常用分子生物学技术常用分子生物学技术原理及其应用原理及其应用第第 1 节节分子印迹与杂交技术分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleicacidhybridization)把不同来源而具有一定同源性的把不同来源而具有一定同源性的DNA分子放在同分子放在同一溶液中做变性处理一溶液中做变性处理，或把单链，或把单链DNA与与RNA放在一放在一起，在一定条件下，它们之间的同源区域可按碱基互起，在一定条件下，它们之间的同源区域可按碱基互补原则复性形成杂合双链补原则复性形成杂合双链(heteroduplex)，这一过程

2、，这一过程称为杂交。称为杂交。在杂交之前，通常用琼脂糖凝胶分离待在杂交之前，通常用琼脂糖凝胶分离待测的测的DNA分子，再将分离的分子，再将分离的DNA片段转移到片段转移到特定的支持物上。由于转移后各个特定的支持物上。由于转移后各个DNA片段片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一样，故称为印迹（样，故称为印迹（blotting）。）。印迹（印迹（blotting）（一）（一）Southern印迹杂交印迹杂交 Southern印迹杂交（印迹杂交（Southernblotting）是是指指DNA与与DNA分子之间的杂交。其基本过程分子之间的杂交。其基本过程是

3、将琼脂糖凝胶电泳分离的待测是将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性片段变性后，将凝胶中的后，将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支分子转移到一定的固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。探针（探针（probe）是指经过特殊标记的是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片段已知序列核苷酸片段，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的序列的DNA或或RNA片段。片段。探针的种类探针的种类 寡核苷酸寡核苷酸基因组基因组DNAcDNA片段片段RNA片段片段标记物标记物 放射性同位素放射性同位素生物素生物素荧光染料荧光染料Sou

4、thern印迹杂交的基本步骤印迹杂交的基本步骤u待测待测DNA样品的限制性内切酶消化样品的限制性内切酶消化u酶切酶切DNA样品的电泳分离样品的电泳分离u凝胶中凝胶中DNA的变性和的变性和Southern转移转移u探针的制备探针的制备uSouthern杂交杂交u杂交结果的检测杂交结果的检测M1 210SSC转转移缓冲液移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜基因组基因组DNA

5、的定性与定量分析。的定性与定量分析。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。重组质粒和噬菌体的分析。Southertblotting用途用途（二）（二）Northern印迹杂交印迹杂交 利用类似于利用类似于Southern印迹杂交的技术来印迹杂交的技术来检测检测RNA称为称为Northern印迹杂交（印迹杂交（Northernblotting）。）。Northern印迹杂交基本原理和过程与印迹杂交基本原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的，可用来对组织或细

6、胞中的mRNA进行定进行定性或定量分析。性或定量分析。Northern印迹杂交的基本过程印迹杂交的基本过程相同点：相同点：名称相对于名称相对于Southern blotting转移的是转移的是RNA转移前无需酶切转移前无需酶切转移效率较高转移效率较高变性方法变性方法不同点不同点原理均为毛细作用原理均为毛细作用 Northernblotting用途用途检测某一组织或细胞中已知的特异检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。的表达水平。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。二、蛋白质印迹技术二、蛋白质印迹技术(Westernblotting)蛋白质

7、印迹技术是根据蛋白质分子之间存在蛋白质印迹技术是根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子对其进行检测。最常用的再用相应的蛋白质分子对其进行检测。最常用的蛋白质是抗体，因此被称为免疫印迹蛋白质是抗体，因此被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。）技术。首先将混合蛋白质用首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小按分子大小分开，再将蛋白质转移到分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。的位

8、置可保持在胶中的原位上。与与DNA和和RNA印迹相似之处印迹相似之处n蛋白质的转移只有靠电转移蛋白质的转移只有靠电转移n蛋白质的检测以蛋白质的检测以抗体抗体作探针作探针n用碱性磷酸酶（用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，）标记第二抗体，底物显色底物显色来检测来检测蛋白区带的信号，底物亦可与蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂化学发光剂结合以提高敏感度。结合以提高敏感度。n或用同位素标记第二抗体，或用同位素标记第二抗体，放射自显影法放射自显影法检测蛋白区带的信号。检测蛋白区带的信号。与与DNA和和RNA印迹不同之处印迹不同之处Westernblotting

9、应用应用检测样品中的特异蛋白质的存在检测样品中的特异蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的定量分析细胞中特异蛋白质的定量分析 蛋白质分子的相互作用研究蛋白质分子的相互作用研究三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较Westernblotting垂直槽垂直槽Northernblotting水平槽水平槽Southernblotting水平槽水平槽第第2节节PCR技术的原理与应用技术的原理与应用（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶链反应聚合酶链反应PCR技术是技术是1985年由美国科学家年由美国科学家KaryBMullis建立的建立的体外体外扩增基因片段的方法，它扩增基因片段的方法

10、，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等易自动化等突出优点突出优点，是分子生物学技术中，是分子生物学技术中一项具有一项具有革命性的创举革命性的创举。PCR方法被美国方法被美国Science杂志评为杂志评为1989年年的十大科技成就之一，而的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶聚合酶被评被评选为象征选为象征1989年的年的“年分子年分子”(themoleculeofyear)。5 Primer15 Primer2Cycle2Cycle15 5 5 5 5 5 TemplateDNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、一、PCR技术的基本原理

11、技术的基本原理Cycle35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530次循环后，模板次循环后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。n模板模板DNAn特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶ndNTPsnMg2+PCR体系基本组成成分体系基本组成成分二、二、PCR技术的主要特点技术的主要特点1.特异性强特异性强2.灵敏度高灵敏度高3.简便快速简便快速4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低2.采用采用PCR方法获得目的基因方法获得目的基因引物选择：引物选择：特异引物、随机引物、简并引物特异引物、随机引物、简并引物1.采用采用RT-P

12、CR方法扩增目的基因方法扩增目的基因三、三、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的扩增与克隆（一）目的基因的扩增与克隆（二）基因的体外定点突变（二）基因的体外定点突变（三）基因突变分析（三）基因突变分析（四）（四）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（五）（五）DNA序列测定序列测定三、三、PCR技术技术的主要用途的主要用途(Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT13OH5双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸脱去脱去DNA链末端合成终止法链末端合成终止法Sanger1958年和年和1980年两次获年两次获Nobel奖奖DNA

13、链末端合成终止法链末端合成终止法DNA自动测序自动测序用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析自动化的基础。析自动化的基础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记4种种ddNTP，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电泳）分离。电泳）分离。通通过过4种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出4种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。DNA自动测序结果自动测

14、序结果四、几种重要的四、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术(RT-PCR)（二）原位（二）原位PCR技术技术(ISP)（三）实时（三）实时PCR技术技术(realtimePCR)RT-PCR技术技术AAnATTnT 55mRNA反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1双链cDNA35 35 5加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR扩增出大量的产物实时实时PCR技术技术原理原理第第3节节转基因技术转基因技术与基因剔除技术与基因剔除技术是指将外源基因整合到动物细胞或是指将外源基因整合到动物细胞或植物

15、细胞的基因组中并使外源基因在动植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术。技术。基因的导入方式主要：基因的导入方式主要：显微注射法显微注射法胚胎干细胞法胚胎干细胞法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法一、一、转基因技术转基因技术即即体细胞克隆技术体细胞克隆技术，是用显微操作、，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。卵细胞内，使之发育成为个体。二、核转移技术二、核转移技术核转移技术可使一个细胞变成一个核转移

16、技术可使一个细胞变成一个个体，这样产生的个体所携带的遗传个体，这样产生的个体所携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖的过程，即样，是一种无性繁殖的过程，即克隆克隆(clone)。通过分子生物学的方法定向地敲除动通过分子生物学的方法定向地敲除动物体细胞内的某个基因的技术称为物体细胞内的某个基因的技术称为基因基因剔除剔除(geneknock-out)或或基因打靶基因打靶(genetargeting)。三、基因剔除技术三、基因剔除技术四、基因转移和基因剔除在医学中的应用四、基因转移和基因剔除在医学中的应用（一）建立疾病动物模型（一）建立疾病动物模

17、型（二）生物制药（二）生物制药（三）治疗性克隆和生产可用于人体器官（三）治疗性克隆和生产可用于人体器官移植的动物器官移植的动物器官第第 4 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术DNA芯片芯片(DNAchip)、DNA阵列阵列(DNAarray)cDNA芯片芯片(cDNAchip)指将许多特定的指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片段片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。面积的支持物上。一、基因芯片一、基因芯片(genechip)将探针将探针与荧光标记的待测样品分子与荧光标记的待测样品分子进行杂交，通过检测系统检测杂交的荧进行杂交，通

18、过检测系统检测杂交的荧光信号和强度，从而获取样品分子的数光信号和强度，从而获取样品分子的数量和序列信息。量和序列信息。将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进进行行定定性性和和定量分析的一种技术。定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片 (proteinchip)又称又称蛋白质阵列蛋白质阵列(proteinarray)基本原理基本原理：蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能蛋白质与蛋白质分子

19、之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。如抗体与抗原特异性的相互识别和相互结合。如抗体与抗原或受体与配体之间的特异性结合。或受体与配体之间的特异性结合。最常用的探针：最常用的探针：抗体，抗体与抗原结合的特异性最强。抗体，抗体与抗原结合的特异性最强。检测方法：检测方法：标记检测法、直接检测法标记检测法、直接检测法第第5节节蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术1989年美国纽约州立大学的年美国纽约州立大学的Fields和和Song首先首先描述了酵母双杂交系统描述了酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。该系统的建立是基于对酵母转录因子该系统的建立是基于对酵母转录

20、因子Gal4分子分子的研究。的研究。转录激活因子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activationdomain)一、酵母双杂交系统一、酵母双杂交系统（一）酵母双杂交系统的基本原理（一）酵母双杂交系统的基本原理N端端C端端这两个结构域各具功能，互不影响这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活

21、因子的功能。因表达的激活因子的功能。（二）酵母双杂交系统的应用（二）酵母双杂交系统的应用1.分析已知蛋白质之间的相互作用及蛋白质分析已知蛋白质之间的相互作用及蛋白质的功能结构域的功能结构域2.筛选和发现新的蛋白质筛选和发现新的蛋白质3.筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响间相互作用的影响4.绘制蛋白相互作用系统图谱绘制蛋白相互作用系统图谱基因组学与蛋白质组学基因组学与蛋白质组学 基因组学是研究生物体基因组的结基因组学是研究生物体基因组的结构、结构与功能的关系、以及基因之构、结构与功能的关系、以及基因之间相互作用的科学间相互作用的科学 包括基因

22、组作图、核苷酸序列分析、包括基因组作图、核苷酸序列分析、基因定位、基因功能分析及调控研究等基因定位、基因功能分析及调控研究等 分为分为结构基因组学结构基因组学和和功能基因组学功能基因组学一、基因组学的概念一、基因组学的概念 二、基因组学的研究内容二、基因组学的研究内容（一）结构基因组学一）结构基因组学四四张张图图谱谱遗传图谱遗传图谱物理图谱物理图谱序列图谱序列图谱转录图谱转录图谱 功能基因组学是建立在结构基因组学功能基因组学是建立在结构基因组学研究基础上的基因组分析研究基础上的基因组分析 主要包括：主要包括：基因功能发现、基因表达分析、突变检测基因功能发现、基因表达分析、突变检测及模式生物研究

23、及模式生物研究等，并且这几方面都与等，并且这几方面都与生生物信息学物信息学密切相密切相关（二）功能基因组学二）功能基因组学 蛋白质组学蛋白质组学 蛋白质组学是蛋白质组学是从整体水平从整体水平研究细胞内蛋研究细胞内蛋白质的组成、结构及其活动规律的科学。白质的组成、结构及其活动规律的科学。蛋白质组学是对蛋白质组学是对不同时间和空间不同时间和空间发挥发挥功能的功能的特定蛋白质群体特定蛋白质群体的研究的研究.一、蛋白质组学的概念一、蛋白质组学的概念 二、蛋白质组学的研究内容二、蛋白质组学的研究内容 总体上可以分为对蛋白质总体上可以分为对蛋白质表达模式表达模式的的研究即蛋白质组组成的研究和对蛋白质组研究即蛋白质组组成的研究和对蛋白质组功能模式功能模式（目前主要集中在蛋白质相互作（目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系）的研究两个方面用网络关系）的研究两个方面