爱滋病病毒实验室诊断课件.ppt

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1、愛滋病病毒實驗室診斷愛滋病病毒實驗室診斷Laboratory Diagnostic on HIV infection講者講者:劉綺芬劉綺芬日期日期:2006/12/031人類免疫缺乏病毒人類免疫缺乏病毒 Human Immnodeficiency Virus;HIV 2逆轉錄病毒科(Retroviridae):反轉錄酵素(reverse transcriptase)將RNA反轉錄成DNA,嵌入宿主之DNA慢病毒屬 Lentivirinae兩條單股RNA Two single strand RNA圓球形Spherical100120nm 人類後天免疫缺乏症候群 Acquried Immunode

2、ficiency Syndrome;AIDS人類免疫缺乏病毒構造人類免疫缺乏病毒構造(HIV Structure)3種系發生圖種系發生圖Phylogenetic treeHuman immundeficiency Virus(HIV)Feline Immunodeficiency Virus(FIV)Simian Immunodeficiency Virus(SIV)4生活史生活史Life Cycle目標細胞 Target Cell:CD4+淋巴球細胞 CD4+T cell、巨噬細胞 Macrophage、單核細胞Monocytes、樹突細胞 Dendritic cell受體CCR5(R5),

3、CXCR4受體(R4)溶合Fusion逆轉錄Reverse Transcription:RNA cDNA整合Integration轉錄 Transcription轉譯 Translation裝配 Synthesis of progeny virus出芽 Budding6HIV 基因結構基因結構 Genome7HIV 基因構造基因構造(HIV-1與與HIV-2的差異的差異)8實驗室檢測實驗室檢測 Laboratory TestP24抗原Antigen抗體 Antibody核酸 HIV-RNA(病毒載量Viral Load)CD4/CD8淋巴球細胞T lymphocytes：正常人的免疫細胞數量通

4、常大於1000/mm3分型及耐藥性病毒培養 Viral Culture10血清學標記血清學標記Serological Markers潛伏期長 latent periord空窗期 window period比抗體檢測提早67日 第二次測得抗原，已開始轉變為受滋病 抗原性可持續數日或數星期，一般在一個月下降 抗原Detection of Antigen 抗體 Detection of Antibody11包被抗原來源包被抗原來源Antigen derived病毒溶解抗原(Whole viral lysate antigen)重組的衍生抗原(Recombinant antigen)合成肽抗原(Syn

5、thetic peptide antigen)13包被抗原血中抗體與抗原反應顯色反應酶免疫法酶免疫法15快速檢測快速檢測-FDA Approval試劑試劑16蛋白質抗原分子經電泳分開血液中的抗體與抗原反應,形成不同的條帶西方印蹟法西方印蹟法 Western Blot18印蹟結果之判讀印蹟結果之判讀WB interpretation19不同國際單位不同國際單位WB判讀準則判讀準則Criteria for interpretation of WB20多种 如果肺炎的诊断成立，评价病情的严重程度、肺部炎症的播散和全身炎症反应程度。除此之外患者如有下列危险因素会增加肺炎的严重程度和死亡危险：（一）病史

6、 年龄65岁；存在基础疾病或相关因素，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、糖尿病、慢性心、肾功能不全、慢性肝病、一年内住过院、疑有误吸、神志异常、脾切除术后状态、长期嗜酒或营养不良。（二）体佂 呼吸频率30次/分；脉搏120次/分；血压20X109/L；呼吸空气时动脉血氧分压（PaCO2）50mmHg;血肌酐106umol/L 或血尿素氮7.1mmol/L；血红蛋白90g/L 或血红细胞比容500/mm3 200500/mm329%14%28%14%減少測量的變異29流式細胞儀31WELLPGL全身性持續淋巴腺病變ARC 愛滋病相群關愛滋病T淋巴細胞與病程32病毒載量病毒載量-核酸的檢測核酸的檢測

7、Viral Load評估評估 Assessing疾病進程Disease prognosis治療開始及治療效果的評估Initiating&evaluation of antiretroviral therapy治療後的病毒載量一般長期處於非常低的水平感染孕婦所生嬰兒的早期診斷Transplacental transmission 33核酸檢測技術Technology of Nucleic acidPCR 聚合酶鏈反應bDNA 支鏈 DNA信號放大技術NASBA 核酸序列擴增系統 34病毒量測定 Viral Load聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應 PCR在生物體外，核酸放大反應，定量人體血漿中的愛滋病病

8、毒(HIV-1 RNA Amplication in vitro)擴增的亞型:M A-G亞型引物Primer:HIV gag區域SK145/SKCC1B 6小時內分出血漿，存於小時內分出血漿，存於-70 C,避免避免RNA降解降解 不用於篩檢,也不單獨當作確認HIV-1感染的診斷Not screening test RNA定量檢測時未測出不等於樣品中不含病毒RNA,每種方法有其可測出的檢測限，一般為50100拷貝數/mL 高靈敏度使容易因污染造成結果的錯誤35抽取核酸物質加入擴增所需元素檢測產物聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應 PCR36RNA 與病程的關係與病程的關係Patients Develop

9、ing AIDS or Dying of AIDS with years,based on Initial HIV RNA Levels37CD4 T淋巴細胞 與 病毒載量38CD4+&HIV-RNA 新感染個案新感染個案InDateCD3CD4CD8HIV1AgHIV1RQ2006/5/000N02005/6/000N02005/10/1086372629147002006/02/1227400719103002006/09/9063325371870039HIV 感染的自然史和病程分期體內播種期急性逆轉錄病毒綜合症期;CD4+急劇下降及病毒血症血清轉換期無症狀HIV感染期(臨床潛伏期)愛滋

10、病前期(ARC)愛滋病期(AIDS):CD4+200/mm3 愛滋病晚期:CD4+50/mm3 40Pro HIV InfectionLate Stage:Core Ab Declines and becomes NegEnvelope Ab:PositiveHIV Ag Becomes positive41HIV/AIDS診斷診斷diagnosisC3B3A3200/mm3(500/mm3(29%)C愛滋病期B愛滋病前期A無症狀HIV感染期臨床分類CD4細胞數范圍所有屬於A3,B3和C1C3均報告為愛滋病42基因變異性 MutationHIV 快速複製以及在反轉錄過程中的缺失及修補,造成不同

11、的變異variants 及品株Strains43亞型分析目的亞型分析目的 Purpose for typing鑑別特定病毒亞型在人群和個體間的傳播,全球地區分布特點推動流行株疫苗的研究揭示HIV的變異方式利用GAG,POL及ENV的基因序列分析,區分基因亞型44HIV SubtypeHIV-1及HIV-2HIV-1M group(10種亞型:Ak)N groupO groupHIV-2(主要分布在西非及印度)6種亞型(AF)HIV-2分離株與SIV常有同樣的抗原,在所有的外套模蛋白質及核心蛋白皆發現異質性只有30%,但是與HIV-1的外套模蛋白比較,僅存有40%的同源性45HIV-1亞型分佈亞

12、型分佈 Distribution of Subtype 東歐(一半B型,另一半A、D、C、F、G)北美、澳洲、巴西及西歐(B亞型)非洲(A和D型)中非(AH型)南非(C亞型)泰國(B及E亞型)印度(A、B、C亞型)韓國(A、B亞型)南美洲(B、F亞型)中國(B、C、亞型)泰國(CRF01_AE)阿根廷及巴西BF重組亞型*澳門已檢測樣本是CRF01_AE、CRF12_BF、B、CRF08_BC、B、A1、A、CRF14_BG46基因多種性因突變及基因重組基因多種性因突變及基因重組宿主同時感染兩種不同的亞型,造成新的基因重組型病毒被命名為CRF(如CRF01_AE),如由三種或者更多的亞型所重組

13、以cpx表示有十多種CRF01_AE,CRF02_AG,CRF04_cpx等等47HIV亞型分析流程圖亞型分析流程圖DNA模板的提取模板的提取巢式巢式PCR PCR 產物回收產物回收PCR產物純化和變性產物純化和變性配制聚丙烯配制聚丙烯胺凝膠胺凝膠電泳電泳核酸全測序儀進行測序和分析核酸全測序儀進行測序和分析電腦軟件作電腦軟件作HIV亞型分析亞型分析測序步驟 48HIV耐藥性檢測耐藥性檢測 Drug Resistance有助於醫生選擇治療方案檢測初次用藥的HIV感染者其耐藥情況用藥過程中產生的耐藥情況北美及西歐有10%的HIV-1病毒的初感染者對最少1種藥物有抗藥性(Medscape 2006/

14、07/21)測量HIV對抗病毒藥物抗性的體外實驗49早期治療的優點 延遲治療的缺點控制病毒複制預防進行性免疫缺損延緩病的進展和死亡預防產生耐藥性較好的藥物耐受性減少病毒傳播生活質量無明顯改善較早出現耐藥性限制將來藥物的選擇長期的藥物毒性有效持續時間不明耐藥毒株的傳播風險降低血中病毒載量,重建病人免疫系統功能50抑制物-Inhibitor51病毒培養 Viral Culture血中培養出病毒為最直接的證據涉及較多的安全設備,需在P3實驗室進行收集健康人的血液單核細胞(PBMC)與病患者的血球共同培養52分析方法之評估分析方法之評估Evaluation of Assay Verification

15、Issues敏感度Sensitivity 特異性Specificity 重覆性Reproducibility簡便Simplicity 價錢及效能Cost/benefit 穩定性Stability 準確度Accuracy 精確度Precision 容易使用Ease of use陽性預測值Positive Predictive Value(%)陰性預測值Negative Predictive Value(%)53結語結語Conclusion無一種檢測可達到100%的靈敏性及特異性 No diagnostic test is 100%specific and 100%sensitiveHIV-1變異

16、株的GAG及POL與主要的分離株基因比較，只有70%的同源性;而ENV則僅有50%的同源性。這些變異造成檢驗試劑無法診斷出某些感染者HIV Highly variable;gag and pol share 70%amino acid sequence homology in some strain,env is 50%.Infection is not detected病源檢測面對的問題Problems with Etiological Diagnosis54多种 肺炎肺炎细菌均可引起大叶性肺炎，但绝大多数为肺炎链球菌，其中以型致病力最强。肺炎链球菌为革兰阳性球菌，有荚膜，其致病力是由于高分

17、子多糖体的荚膜对组织的侵袭作用。少数为肺炎杆菌、金黄*色葡萄球菌、溶血性链球菌、流感嗜血杆菌等。肺炎链球菌为口腔及鼻咽部的正常寄生菌群，若呼吸道的排菌自净功能及机体的抵抗力正常时，不引发肺炎。当机体受寒、过度疲劳、醉酒、感冒、糖尿病、免疫功能低下等使呼吸道防御功能被削弱，细菌侵入肺泡通过变态反应使肺泡壁毛细血管通透性增强，浆液及纤维素渗出，富含蛋白的渗出物中细菌迅速繁殖，并通过肺泡间孔或呼吸细支气管向邻近肺组织蔓延，波及一个肺段或整个肺叶。大叶间的蔓延系带菌的渗出液经叶支气管播散所致。编辑本段编辑本段临床表现临床表现多数起病急骤，常有受凉淋雨、劳累、病毒感染等诱因，约1/3患病前有上呼吸道感染。病程710天。（一）寒战、高热：典型病例以突然寒战起病，继之高热，体温可高达3940，呈稽留热型，常伴有头痛、全身肌肉酸痛，食量减少。抗生素使用后热型可不典型，年老体弱者可仅有低热或不发热。精品PPT课件 浏览免费 下载后可以编辑修改。55