专业分析第一章-绪论-课件.ppt

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1、专业分析2023/5/26第一章 绪论第二章 水分测定第三章 酸的测定第四章 碳水化合物测定第五章 蛋白质及氨基酸的测定第六章 物理分析法第七章 仪器分析法2023/5/26第一章 绪论1.1 课程性质、目的、内容和要求1.2 样品采集、处理与保存1.3 分析方法的选择1.4 分析误差与数据处理2023/5/261.1 课程性质、内容、目的和要求课程性质：专业基础课，专门研究与生物工程有关的物质成分定性和定量分析理论和实际操作技能的一门学科2023/5/26课程目的和任务：通过学习和操作性能的训练，学会对不同检测项目选用适当的分析方法，掌握经典的化学组分的物理、化学分析原理和操作要点，掌握常用

2、分析仪器的工作原理、构造、性能、使用方法及其维护知识，能独立运用物理、化学和常用仪器分析方法，对生物工程工业生产和科研中有关原料、半成品、成品、副产品和其它样品进行测定，培养正确判断和表达专业分析结果的能力。同时培养初步的科学研究的能力。2023/5/26主要内容是分析方法和仪器分析方法，包括样品的采集处理、数据处理记录、生物样品的酸度、碳水化合物、氨基酸和蛋白质的物理分析方法、化学分析方法和包括大部分生物样品的组分的仪器分析方法的原理和实际操作要点。课程内容为什么要检测这些内容？2023/5/26要求：（1）掌握生物工程样品分析的基本知识，熟悉各种基本概念、名词和术语，并正确理解它们的意义及

3、应用范围；（2）掌握样品的采集、制备、处理与保存的一般方法；（3）掌握生物工程样品主要成分的分析原理和基本操作技术；（4）通过实验了解分析的方法、操作技术、仪器设备的使用方法。（5）培养正确观察、记录实验现象和处理数据，正确运算和表达结果并能写出正确的实验报告，从而进一步提高生产和科学研究中分析和解决问题的能力。2023/5/26常用的分析方法采用的方法主要有：感官检测法；化学分析法；仪器分析法；微生物分析法；酶分析法2023/5/26化学分析法化学分析法是以物质的化学反应为基础，使被测组分在溶液中与试剂作用，由生成物的量或消耗试剂的量来确定组分和含量的方法。主要有重量法和容量法 重量法:水分

4、 灰份 脂肪 纤维 果胶 容量法:酸碱滴定:酸度 蛋白质氧化还原滴定:Vc沉淀滴定:Cl络合滴定:Ca 2+即使是仪器分析也是以化学分析法为基础的，化学分析是最基本的分析方法2023/5/26物理化学分析法包括:光学分析法：紫外可见光分光光度法芳香化合物、蛋白质、核酸 原子吸收分光光度法 大部分元素 荧光分析法 维生素 红外光谱法 氨基酸 电化学分析法 电位分析（pH分析、离子选择性电极分析）、电导分析（溶液中的离子浓度：水的纯度 糖品灰分），电容量分析（如电位滴定)色谱分析法 薄层色谱 有机酸 黄曲霉素 气相色谱 小分子的氨基酸、脂肪酸 高效液相 维生素 糖类 农药残留 质谱分析和色质联用分

5、析 2023/5/26分析的一般程序 1、样品的采集制备和保存 2、样品的预处理 3、成分分析 4、分析数据处理 5、分析报告的撰写 2023/5/261.2 样品采集、处理与保存是分析检验的第一步，是正确分析的一个重要环节一、样品的采集二、样品的制备 三、样品的保存四、样品的预处理2023/5/26采样方法随机抽样及其特点：随机原则，可避免人为倾向性代表性取样及其特点：时间空间变化规律、代表性通常采用两种方法结合的方式采样数量数量的确定要考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度样品（指平均样品）一式三份，分别供检验、复验和被查采样注意事项1、一切采样器、容器保持清洁，防止将非样品

6、物带入样品中2、设法保持样品原有微生物状况和理化指标(不污染,变化)3、易变化的样品,应及时分析检验4、样品器具上应贴标签表明名称、日期、地点、批号2023/5/26二、样品保存1、一般情况下,即时分析。不能马上测试的样品，应正确保存以防止水分、挥发性成分散失,防止待测组分含量发生变化（如分解,发酵等）。2、洁净,密封,阴暗处保存 易腐败变质的样品应保存在0-5 冰箱，易发生光解的需避光保存(VB1、胡萝卜素、黄曲霉B1)3、存放样品,按日期,批号,编号摆放,以便查找 2023/5/26三、样品的预处理对待测样品进行分离、掩蔽,以排除干扰组分，进行浓缩处理以提高待测成分含量的操作过程称为样品的

7、预处理。样品预处理的目的：发酵样品成分复杂，往往以复杂的结合态存在,造成对检测的影响；有的样品待测成分含量过低，必须进行浓缩处理提高含量；有的样品则需要去除杂质预处理过程排除干扰因素,完整保留被测组分,以获得理想测定结果，所以样品的预处理是发酵分析过程中的重要环节预处理的方法有6种：有机物破坏法、溶剂提取法、蒸馏法、色层分离法、化学分离法、浓缩法。应根据分析对象、被测组分理化性质、含量及分析方法，确定预处理方法。如：HPLC检测蛋白的去除2023/5/26（一）有机物破坏法 通过高温或高温加强氧化条件使有机物分解，使被有机物结合的待测成分转化为无机物状态的成分，主要用于测定食品中除汞以外的金属

8、元素及部分非金属元素,分干法和湿法预处理1、干法预处理-灼烧法（1）原理：样品 在坩埚加热脱水，炭化，分解，氧化灰化(高温电炉500-550灼烧)白(灰)色残渣(得到无机成分)提高准确度的措施采取适宜的灰化温度(降低温度)采用低温灰化技术，在150度以下即可使样品灰化加入助灰化剂，防止挥发损失和坩埚吸留如:加入 氯化镁或硝酸镁可使磷、硫元素转变为难挥发的磷酸镁和硫酸镁，加入氢氧化钠或氢氧化钙可使卤素转变为难挥发的钠和钙盐2023/5/262、湿法消化 简称消化法（1）原理 加入浓硝酸、浓硫酸、HClO4、KMnO4、H2O2 等强氧化剂,加热消化使有机物分解氧化,以气态挥发，而待测组分以无机物

9、状态存在于消化液中。是常用的方法（2）消化法的特点 有机物分解速度快,时间短 温度低,挥发少,吸留少 产生有害气体,需通风柜中进行 消化初期,易产生大量泡沫（3）常用方法包括硝酸高氯酸硫酸法、硝酸硫酸法2023/5/262、提取方法 提取方法可归纳为三种：浸提法、溶剂分层法、（1）浸提法：将(固体如离心后的湿菌体)样品放入溶剂中浸泡,使被测组分溶于溶剂中,分为震荡法和捣碎法。前者为将样品切碎用溶剂浸泡，回收率较低；后者将样品与溶剂用捣碎机共同捣碎一段时间的方法，回收率高，但杂质也高2023/5/26（四）色层分离法 色层分离法又称色谱分离法。根据原理不同,可分为:吸附色谱分离、分配色谱分离、离

10、子交换色谱分离1、吸附色谱分离 用吸附剂选择性的吸附被测成分或干扰成分，常用吸附剂有硅藻土、硅胶、氧化铝、聚酰胺，如 聚酰胺吸附色素 2、分配色谱分离 根据不同物质在固定相和流动相间的分配比不同而进行分离的方法，如多糖类物质的酸水解后的纸层析，定性检测和分离3、离子交换色谱分离 利用离子交换剂与溶剂中离子间所发生的交换反应来进行的分离方法2023/5/26（五）化学分离法1、沉淀分离法 利用沉淀反应进行分离的方法。在试样中加入沉淀剂,使被测组分或干扰成分沉淀下来,经过滤或离心分离。例如,测纯蛋白,可加入重金属,使蛋白质下降,再测其沉淀的氮量，或者加入的重金属使蛋白质沉淀，使待测物质留在溶液中。

11、2、掩蔽法 利用掩蔽剂与干扰成分作用,使干扰成分转变为不干扰测定状态。利用这种方法,可不经分离干扰成分，,简化了分析步骤。如Cu 2 Cd 2等离子对铅的测定有干扰，可采用加入氰化钾和柠檬酸铵掩蔽。2023/5/26 选择正确的分析方法是保证分析准确的关键环节一、选择方法应考虑的因素：分析要求的准确度和精密度分析方法的繁简和速度样品特性如形态、含量及干扰物的影响程度现有条件如长链脂肪酸和挥发性脂肪酸的检测 评价一个分析方法时，常用精密度、准确度和灵敏度三项指标2023/5/26二、精密度及其表示 指多次平行测定结果相互接近程度，代表测定方法的稳定性及重现性，测定结果差异来自偶然误差，精密度高低

12、可用偏差表示：绝对偏差：测定结果与平均值之差，d相对偏差：绝对偏差占平均值的百分比分析结果的精密度常用平均偏差和标准偏差表示2023/5/262.标准偏差相对标准偏差称为变异系数 相对标准偏差：（变异系数）CV%=S/X 标准偏差又称均方根偏差；标准偏差：2023/5/26三、准确度及表示指测定值与真实值的接近程度，主要由系统误差决定，反映测定结果的可靠性。准确度高的方法其精密度必然高，但相反则不一定。准确度可用误差表示，误差小，则准确度高误差分为绝对误差与相对误差，绝对误差指测定结果与真实值之差，而相对误差指绝对误差占真实值的百分率。精密度:指多次平行测定结果相互接近程度，代表测定方法的稳定

13、性及重现性，测定结果差异来自偶然误差，2023/5/26四、灵敏度指分析方法所能检测到的最低限量。不同方法有不同灵敏度，一般仪器分析法高于化学分析法2023/5/261.4 定量分析中的误差与数据处理一、误差的来源二、控制和消除误差的方法三、分析数据的处理四、实验数据的处理2023/5/26误差的来源真实值测定值误差：测定值与真实值的差异，分为系统误差和偶然误差2023/5/26系统误差由固定原因造成的误差，在测定过程中按一定规律重复出现，有方向性即偏高或偏低系统误差大小是可测的，来源于分析方法、仪器、试剂和主观认识（对操作规程和操作条件等因素）引起的误差2023/5/26偶然误差由于偶然外因

14、引起的误差，产生的原因不固定、大小不一，或正或负；可能是由环境（气压、温度、湿度）变动或仪器性能、分析人员对各个样品处理不一致造成。2023/5/26控制和消除误差的方法1.正确选择样品量2.增加平行测定次数，减少偶然误差对照试验:与标准试样的标准结果进行对照;2.实验数据的处理可疑值的取舍同一个样品多次测定的结果中，个别数据与其它数据相差较大时，对这些极端数据不可随意丢弃应有足够的理由认为是由于操作失误或干扰引起的，则可剔除，否则应依据误差理论决定取舍，方法包括：4d 法、格鲁布斯(Grubbs)法、Q 值确定法2023/5/26（1）4d 法求异常值之外的各数据的平均值求异常值之外的各数据

15、对平均值 的差的平均值，即平均偏差。计算异常值与 的差值求 比值，若大于4则舍去，否则保留。当4d法与其他检验法矛盾时，以其他法则为准。异常值xD2023/5/26例 测定某药物中钴的含量如(g/g),得结果如下：1.25，1.27，1.31，1.40。试问1.40这个数据是否应保留?解 首先不计异常值1.40，求得其余数据的平均值 和平均偏差为异常值与平均值的差的绝对值为|1.40一1.28|=0.124(0.092)故1.40这一数据应舍去。2023/5/26（2）格鲁布斯(Grubs)法 有一组数据，从小到大排列为:x1,x2,xn-1,xn 其中x1或xn可能是异常值。用格鲁布斯法判断

16、时，首先计算出 该 组 数 据 的 平均 值 及 标 准 偏 差，再根据统计参数G进行判断(G是 和n的函数)。若GTa,n，则异常值应舍去，否则应保留=1-置信水平 n样品个数2023/5/262023/5/26例 前一例中的实验数据，用格鲁布斯法判断时，1.40这个数据应保留否(置信度95%)?解:各样的平均值 x=1.31，标准偏差 s=0.066 查表T005，4=1.46，TT005，4，故1.40这个数据应该保留。格鲁布斯法优点，引人了正态分布中的两个最重要的样本参数x及s，故方法的准确性较好。因此得到普遍采用。1.25，1.27，1.31，1.402023/5/26（3）Q检验法

17、(当测定次数n=3-10时采用)设一组数据，按递增顺序排列为:x1,x2,xn-1,xn显然x1（或xn）为离群值，则统计参数Q为：式中分子为异常值与其相邻的一个数值的差值，分母为整组数据的极差。Q值越大，说明xn离群越远。Q称为“舍弃商”。当Q计算Q表时，异常值应舍去，否则应予保留。分析化学中通常取0.90的置信度。2023/5/261.25，1.27，1.31，1.402023/5/26例：测定某一热交换器水垢中的Fe2O3百分含量，进行7次平行测定，经校正系统误差后，其数据为79.58，79.45，79.47，79.50，79.62，79.38和79.80。解：数据中79.80与其余6个

18、数据相差较大，现根据Q检验决定其取舍。已知n=7时，Q0.90=0.51,所以79.80应予保留。2023/5/263.标准曲线绘制 光度法及色谱法分析中，常需绘制标准曲线，但在绘制时，常出现1 至2 个点偏离的情况，此时线性拟合Excell 程序。2023/5/26思考题分析方法选择遵循的原则是什么？精密度、准确度和灵敏度对分析方法评价的意义是什么？系统误差和偶然误差的来源是什么？控制和消除误差的方法有哪些？数据计算时有效位数保留原则是什么？实验数据中可疑值如何取舍？2023/5/26分批培养中柠檬酸钠对苏云金素分批培养中柠檬酸钠对苏云金素 生物合成的调控作用生物合成的调控作用应用举例202

19、3/5/26苏云金素与聚3-羟基丁酸的代谢关系苏云金素与腺嘌呤从头合成途径有关，因而与糖酵解、三羧酸循环有密切关系。苏云金素与PHB位于碳中心代谢途径的不同方向，两者的合成属于碳源的竞争关系。因此，碳代谢流在代谢网络中的分配，将会影响两者的合成。减少PHB的合成量可能会提高苏云金素产量和对底物的转化率。2023/5/26 本实验采用细胞破碎后氯仿萃取UV吸收法检测胞内PHB。PHB的回收率在98%-103%，相对标准偏差在1-2.0%之间。满足光谱法测定的准确性和重复性要求。4.3.1 紫外分光光度法检测PHB的回收率和相对标准偏差2023/5/263 h-21 h糖消耗很快，生物量迅速增加。

20、苏云金素在9 h时开始合成。21 h后葡萄糖消耗与菌体生长缓慢，但苏云金素仍在继续合成。PHB伴随菌体生长而合成，24hPHB含量为菌体干重的16.0。4.3.2 苏云金素与PHB生物合成的代谢关系2023/5/26有机酸检测显示：12 h时，乙酸谷氨酸含量达到峰值，随后降低。这与pH值趋势一致。2023/5/26苏云金素与PHB同期合成，合成PHB会减少苏云金素合成的碳骨架供量。柠檬酸钠分批培养添加实验，如图4.4：2.0 g/L的柠檬酸钠添加量提高苏云金素产量56.0；PHB含量比对照低30.0。出于工业化生产考虑，在3.0 L罐水平进行分批培养重复试验。2023/5/261.生物量与菌体

21、对葡萄糖得率没有差别。2.pH值变化的差异很大：添加柠檬酸钠后，菌体代谢状态发生改变。2023/5/269h有机酸达峰值。乙酸与丙酮酸浓度比对照降低50.0-66.0；谷氨酸量提高20.0-40.0。YBT-1532分批培养过程中添加柠檬酸钠对有机酸的影响2023/5/26l 由图4.7：添加柠檬酸钠后丙酮酸激酶活性比对照降低了36%-45%；而6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性较对照升高了0.50-1.2倍。两种培养条件下丙酮酸激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性变化2023/5/26l 柠檬酸含量为0.54 g/L，仅比对照高3.8。l 2-酮戊二酸浓度是0.28 g/L，高于对 照（0.23 g/L）2

22、1.7。l 腺嘌呤浓度由对照的 0.017 g/L提高至 0.024 g/L，增加了41.1。分批培养27 h后，柠檬酸、2-酮戊二酸和腺嘌呤在发酵液中的积累情况：2023/5/26（1）6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性提高0.5-1.2倍除了说明HMP途径碳流量增大以外，还会引起NADPH供量增大，满足了谷氨酸合成对还原力需求，谷氨酸产量提高20.0-40.0。（2）丙酮酸激酶活性比对照降低了36%-45%，表明糖酵解途径碳流量降低；乙酸和丙酮酸含量低于对照一倍以上，说明PHB合成的前体大幅下降，导致菌体合成PHB的能力下降了29.6，葡萄糖对PHB得率减少30.6（3）柠檬酸根作为碳源参与了TCA循环代谢，保证菌体的能量需求，并引起2-酮戊二酸的积累。柠檬酸钠促进了葡萄糖在糖酵解途径与HMP途径代谢量比例的调整，实现了碳代谢流从糖酵解途径向磷酸戊糖途径的迁移，促进腺嘌呤合成比对照提高41.1。由于苏云金素分子中的腺嘌呤和核糖都与HMP途径及核苷从头合成途径有关。因此，细胞合成苏云金素的能力提高了45.7以及葡萄糖对苏云金素的得率增加41.6。YBT-1532合成苏云金素与PHB关系的阐明，为定向改造菌种提供了方向。4.4 小结2023/5/26Thank you2023/5/26