HLA一DPA13-UTR单核营酸多态与慢性乙型肝炎病毒感染及肝癌的遗传易感性研究.doc

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1、 HLA一DPA13UTR单核营酸多态与慢性乙型肝炎病毒感染及肝癌的遗传易感性研究【立项依据】：人类白细胞抗原(humanleueoeyteantigens，HLA)作为免疫应答的重要基因群，与抗HBV免疫反应及HCC的发生均有着密切的关系。HBV感染已成为重要的全球性公共卫生问题，预计全球1/3的人口感染过HBV。感染HBV后机体会出现不同的疾病转归，大部分可自愈，其中约5%发展为慢性感染，如慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB），肝硬化（liver cirrhosis, LC）及原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。HBV感染

2、的致病机理较复杂，遗传因素在HBV致病过程中起到了重要的作用，而广泛存在于基因中的基因多态性，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）可导致机体对各种慢性损伤的反应具有明显的个体差异，影响疾病的易感和不同的疾病转归。HLA复合体是首次发现的与疾病有明确关系的遗传系统。而HLA与疾病的关联主要取决于其丰富的基因多态性。尤其是HLAll类基因多态性。最新的针对日本和泰国人群中的研究已经证实位于HLA一D队1基因3UTR单核营酸多态rs3077刀G与慢性乙型肝炎有关。尽管HBV持续慢性感染机制、与HCC的关系以及HCC自身发生机制尚未明确，但机体对病

3、原微生物或肿瘤抗原的免疫反应无疑在疾病进展过程中起关键作用。 HLA的主要生物学功能是提呈蛋白质抗原。主要与T细胞免疫有关，由于抗原必须在细胞表面展示，才能被T细胞识别，HLA的作用就是将内源性或外源性抗原以HLA一肤复合物的形式，通过T细胞表面的TCR，传递给CD4+和CDS+T细胞，以激活T细胞产生免疫。同时，它通过影响T细胞在胸腺内的发育而塑造个体的细胞库(与免疫耐受有关)，通过影响对抗原肤的选择性结合和提呈而控制适应性免疫应答。HLAI类分子主要参与内源性抗原的提呈，HLAll类分子主要参与外源性抗原的提呈，但也存在交叉提呈现象。 而HLA与疾病的关联主要取决于其丰富的基因多态性。HL

4、A基因多态性一方面决定了HLA分子所能递呈抗原肤的基序，另一方面影响T细胞对抗原的识别。从而造成不同HLA分子结合和提呈抗原肤能力的差异。使得不同的HLA基因对疾病的易感性不同，对同一抗原的免疫应答强度也不同，进而导致疾病转归不同，使其成为可能影响HBV感染慢性化及HCC发生的主要因素之一，这也是HLA以多态性参与调控对HBv及HCc免疫应答的重要机制。最近的一篇报道来自Kamatani和其同事20实施的一组针对日本和泰国人群的HBV持续感染和基因变异的全基因组关联研究，起始的基因体关联分析比较慢性HBV感染日本病患(共 179位)与健康个体(共934位)，研究中P值最小的的单一核普酸基因多态

5、性(SNPS)，再进一步与607位独立的HBV感染与 1267位对照组个体身上确认，共找出一1个显著与慢性HBv感染有关的sNPS(P值=3.62Xlo一8到1.16xlo一，3)。这11个SNPS都位于或接近HLA一DPAI与HLA一DPBI基因。重新检验以 1300例患者和2100例对照者为研究对象的两项日本和一项泰国队列研究中，进一步确认了与慢性HBV感染有关的两个SNPs，HLA一DPAI基因rs3O77A/G与HLA一DPBI基因rs9277535A/G(复合P值分别为 6.34x10一3，和 2.31x10一38，OR=0.57和0.56)。这两个区域的G等位基因与慢性感染有关，而

6、A等位基因则与保护力有关。研究者推测这些基因可能会导致HLA一DP分子抗原提呈效应从而导致HBv持续感染。2010年8月，Hongxing Zhang等报道了一项中国人群的GWAS研究结果，位于人类染色体1p36.22的KIF1B基因的rs17401966位点与HBV相关肝癌有关，该位点是否在HBV感染不同结局及药物治疗预后中同样存在相关性。2011年7月，一项来自日本的全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）发现，HLA-DQ基因的SNP位点rs2856718与CHB有关；Vinod Kumar等，报道了一项GWAS研究结果，HLA-DQ基因的

7、SNP位点rs9275572与丙型肝炎病毒相关性肝癌有关，该位点是否与HBV感染同样具有相关性，在中国人群中是否存在这种关联，是否与抗病毒药物治疗预后相关，尚未见相关报道。此外，有实验研究发现了与HBV感染结局相关的差异蛋白-真核肽链释放因子GTP结合亚单位（eRF3b），它是由GSPT2基因编码，它与eRF3a（由GSPT1编码，与eRF3b高度相似，87%的氨基酸序列相同）共同参与中止真核生物蛋白合成的过程。前期，进行了关于这两种蛋白与HBV感染的功能学研究，即将探讨GSPT1和GSPT2基因的两个SNP位（rs33635和rs974285）与HBV感染及治疗预后的相关性。实验结果显示：1

8、HLA-DQ多态性位rs2856718与HBV感染及其结局的关系在共显性模型下，携带rs2856718AGrs2856718GG基因型的个体感染HBV的风险降低，OR值分别为0.738和0.4（95%CI=0.571-0.954,P=0.020；95%CI=0.331-0.636, P0.001）；在显性模型（GG+AG vs AA）和隐性模型（GG vs AA+AG）下，OR值分别为0.641和0.541（95%CI=0.505-0.814, P0.001；95%CI=0.403-0.725, P0.001）；吸烟和饮酒均为HBV感染的独立危险因素（OR=1.688, P=0.006；OR=

9、1.507,P=0.001）；rs2856718与HBV自然清除相关，在共显性模型下，rs2856718与HBV自然清除有关联，携带rs2856718AG和rs2856718GG基因型的个体HBV自然清除能力强（AG vs AA, OR=0.642,95%CI=0.479-0.773,P=0.003; GG vs AA, OR=0.528,95%CI=0.361-0.773, P=0.001）；在显性模型下，rs2856718GG+AG基因型携带者HBV自然清除能力更强，发展为HBV慢性感染的可能性为rs2856718AA基因型携带者的0.610倍（95%CI=0.463-0.805, P0.

10、001）；在隐性模型下，rs2856718GG基因型携带者HBV自然清除能力强，发展为HBV慢性感染的可能性为rs2856718AA+AG基因型携带者的0.688（95%CI=0.492-0.962,P=0.029）；吸烟为HBV感染的独立危险因素（OR=1.512,95%CI=1.009-2.264, P=0.045）。2HLA-DQ多态性位点rs9275572与HBV感染及其结局的关系rs9275572与HBV易感性有关联。在共显性模型下，携带rs9275572AG或rs9275572AA基因型的个体感染HBV的风险降低，OR值分别为0.706和0.374（95%CI=0.553-0.90

11、3, P=0.006；95%CI=0.244-0.573, P0.001）；在显性模型（AA+AG vs GG）下和隐性模型（AA vs GG+AG）下，OR值分别为0.627和0.429（95%CI=0.498-0.790, P0.001；95%CI=0.283-0.650, P0.001），吸烟和饮酒均为HBV感染的独立危险因素（OR=1.635, P=0.002; OR=1.582, P=0.002）。rs9275572与HBV的自然清除相关，在共显性模型下，携带rs9275572AG基因型的个体HBV自然清除率更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs9275572GG基因型携带者的0.

12、719倍（95%CI=0.544-0.949, P=0.020）；在显性模型下，携带rs9275572AA+AG基因型的个体HBV自然清除率更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs9275572GG基因型携带者的为0.714（95%CI=0.547-0.932, P=0.013）；吸烟是HBV自然清除的独立危险因素（OR=1.527,95%CI=1.022-2.282, P=0.039）。3GSPT多态性位点rs33635和rs974285与HBV感染及其结局的关系本研究尚未发现rs33635和rs974285两个SNP位点与HBV易感性、HBV自然清除及LC进展和HCC进展的相关性。4KIF

13、1B多态性位点rs17401966与HBV感染及其结局的关系本研究发现rs17401966基因多态性与HBV自然清除有关联，携带rs17401966GG基因型的个体HBV自然清除的可能性更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs17401966AA基因型携带者的0.568倍（95%CI=0.361-0.894, P=0.015）；rs17401966基因多态性与HBV易感性、LC进展及HCC进展无关联。5基因-基因交互作用经MDR分析，在HBV易感性研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718、 rs9275572）、 GSPT1位点（rs33635）和KIF1B位点（rs1740

14、19664）之间的交互作用（P=0.0010），高危组合易感风险为低危组合的2.643倍（95%CI=1.458-3.487）。在HBV自然清除研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718、rs9275572）、GSPT1位点（rs33635）和KIF1B位点（rs174019664）之间的交互作用（P=0.023），与HBV自然清除的关联强度为2.024（95%CI=1.156-3.958）。在LC进展和HCC进展研究中均未发现基因-基因间的交互作用。6基因-环境交互作用经MDR分析，在HBV易感性研究中，准确性和交叉检验一致性最高的因子模型为HLA-DQ位点（rs927557

15、2）、吸烟和饮酒的交互作用（P=0.0010），高危组合易感风险为低危组合的3.014倍（95%CI=1.647-4.963）。在HBV自然清除研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718）和饮酒的交互作用模型（P=0.0010），与HBV自然清除的关联强度为1.923（95%CI=1.185-4.032）。在LC进展研究中，未发现有统计学意义的基因-环境交互作用模型。在HCC进展研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718）、GSPT1位点（rs33635）、KIF1B位点（rs17401966）和吸烟间的交互作用（P=0.0110），高危组合易感风险为低危组合的

16、1.847倍（95%CI=1.265-3.468）。研究拟探讨HLA-DQ （rs28567185和rs9275572）、GSPT（rs33635和rs974285）及KIF1B（rs17401966）五个候选基因与LAM治疗后不同结局的相关性。方法：选择符合条件的研究对象354例，以问卷形式收集研究对象的一般情况，并收集外周血，提取DNA，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS）实验平台进行DNA的SNPs分型。经LAM

17、治疗6个月后，根据病毒学应答（DNA载量3log copies/ml或下降2log copies/ml）与否分为两组（DNA应答组与DNA非应答组），根据生化学应答（治疗后ALT在正常参考值范围）分为ALT应答组和ALT非应答组。先进行单因素分析，再用非条件Logistic回归分析校正混杂因素，分析SNP位点与HBV易感性及其感染结局的关联，并用多因子降维法进行基因-基因和基因-环境之间的交互作用分析，由SPSS16.0统计软件、MDR2.0及MDRPT V0.4.6完成数据分析。结果：1HLA-DQ多态性位点rs2856718与DNA应答及ALT应答的关系rs2856718与DNA应答无关联

18、，但与ALT应答具有相关性，rs2856718A等位基因更容易出ALT应答，在共显性模型下（GG vs AA），OR值为2.458（95%CI=1.277-4.730，P=0.007）；在显性模型（GG+AG vs AA）和隐性模型（GG vs AA+AG）下，OR值分别为1.691（95%CI=1.093-2.615，P=0.018）和2.040（95%CI=1.104-3.772，P=0.020）；性别是ALT应答的独立影响因素，男性ALT应答率低于女性，年龄、吸烟及饮酒与ALT应答无关联。2HLA-DQ多态性位点rs9275572与DNA应答及ALT应答的关系rs9275572与DNA应

19、答相关，rs9275572G等位基因更容易出DNA应答，共显性模型（AG vs GG: OR=2.062,95%CI=1.153-3.687，P=0.015; AAvs GG: OR=5.553,95%CI=1.827-16.877，P=0.003）、在显性模型下（AA+AG vs GG: OR=2.599,95%CI=1.525-4.428，P0.001）和隐性模型下（AAvs GG+AG: OR=4.684,95%CI=1.552-14.133，P=0.006）均具有相关性；男性患者拉米夫定治疗后DNA应答的可能性较女性低。rs9275572基因多态性与ALT应答具有相关性，rs92755

20、72G等位基因更容易出ALT应答，在共显性模型下（AG vs GG: OR=2.037,95%CI=1.231-3.369, P=0.006; AA vs GG: OR=3.245,95%CI=1.415-7.440,P=0.005）、在显性模型下（AA+AG vs GG: OR=2.279,95%CI=1.442-3.602,P0.001）和隐性模型下（AA vs GG+AG:OR=2.678,95%CI=1.182-6.068,P=0.018）均存在此关联；性别与ALT应答相关，男性LAM治疗后的ALT应答的可能性低于女性（OR=0.509,95%CI=0.297-0.872,P=0.01

21、4），年龄、吸烟和饮酒与ALT应答均无相关性。3GSPT1多态性位点rs33635与DNA应答及ALT应答的关系rs33635C等位基因携带者更易发生DNA应答，在共显性模型下（CCvs TT），rs33635CC基因型携带者DNA应答的可能性为rs33635TT基因型携带者的2.449倍（95%CI=1.057-5.674, P=0.037）；在隐性模型下（CCvs TT+CT），rs33635CC基因型携带者DNA应答的可能性为rs33635TT+CT基因型携带者的2.551倍（95%CI=1.138-5.716, P=0.023）；性别为DNA应答的独立影响因素，男性DNA应答的可能性降

22、低。在共显性模型（CC vs TT）和隐性模型下（CC vs TT+TC），rs33635C等位基因携带者更易发生ALT应答（OR=3.587,95%CI=1.727-7.450,P=0.001; OR=3.840,95%CI=1.910-7.720, P0.001）；性别与ALT应答相关，男性患者ALT应答的可能性均降低。4GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的关系尚未发现GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的相关性。5KIF1B多态性位点rs17401966与DNA应答及ALT应答的关系rs17401966与DNA应答具有相关性，rs1740

23、1966G等位基因携带者更易发生DNA应答，在共显性模型下（AG vs AA），OR值为3.141（95%CI=1.826-5.403, P0.001），在显性模型下（GG+AG vsAA）， OR值为3.483（95%CI=2.045-5.932, P0.001）；在隐性模型下（GG vsAA+AG），OR值为5.350（95%CI=1.176-24.347, P=0.030）；性别、年龄为DNA应答的独立影响因素，吸烟和饮酒对DNA应答无影响。rs17401966G等位基因携带者更易发生ALT应答，在共显性模型（AGvs AA）和显性模型（GG+AG vs AA）下，rs17401966与

24、ALT应答具有相关性（OR=1.941,95%CI=1.231-3.063, P=0.004; OR=1.687,95%CI=1.089-2.615, P=0.019）；性别是ALT应答的独立影响因素，年龄、吸烟及饮酒对ALT应答均无影响。第三部分HLA-DP基因多态性与HBV感染的Meta分析目的：采用Meta分析的方法，对国内外不同人群的研究结果进行综合评价，以证实HLA-DP基因的rs3077和rs9277535两个SNP位点是否与HBV感染及HBV自然清除有关。方法：以“rs3077”为检索词，检索中国生物医学文献数据库、中国学术期刊全文数据库及Pubmed数据库。共检索到7篇文献，以

25、“rs9277535”为检索词，共检索到8篇文献，经过仔细阅读，共8篇文献纳入meta分析，其中，有两篇文献分别包括4个阶段的研究数据，共获得16个亚组数据，有12个亚组数据用于rs3077位点的meta分析，14个亚组数据用于rs9277535位点的meta分析。提取纳入文献的信息如下：第一作者、出版年、研究设计类型、受试者来自的国家和种族、病例组和对照组的定义和数量、提取DNA和分型的方法。文献未提供等位基因频率的，利用相应的基因型计算，分别提取rs3077和rs9277535位点的相关数据，本研究对rs3077和rs9277535位点的等位基因、共显性模型、显性模型及隐性模型进行了met

26、a分析。计算优势比（OR）及其95%CI作为效应量。首先对纳入分析的原始文献进行Q检验，分析异质性，根据异质性检验结果，选择固定效应模型或随机效应模型求其效应合并值。用漏斗图和Eggers检验进行发表偏倚分析，以P0.05为差异有统计学意义。所有数据用STATA10.0分析。结果：1HLA-DPA1rs3077与HBV感染及HBV自然清除的关系经meta分析，结果表明，携带HLA-DPA1rs3077A等位基因为HBV感染的保护性因素（OR=0.556，95%CI=0.527-0.586, P0.001），携带HLA-DPA1rs3077A等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带HLA-DP

27、A1rs3077G等位基因个体的0.556倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同（AGvsGG, OR=0.522，95%CI=0.485-0.561, P0.001；AAvsGG, OR=0.350，95%CI=0.311-0.393, P0.001；GA+AAvsGG,OR=0.478，95%CI=0.446-0.513, P0.001；AAvsGA+GG, OR=0.480，95%CI=0.429-0.536, P0.001）。携带HLA-DPA1rs3077A等位基因的个体感染HBV后自然清除的可能性高，发展成CHB的可能性降低（OR=0.654，95%CI=0.6110.70

28、1, P0.001），为携带HLA-DPA1rs3077G等位基因个体的0.654倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同（AGvsGG, OR=0.636，95%CI=0.577-0.702, P0.001；AAvsGG,OR=0.446，95%CI=0.383-0.520, P0.001；GA+AAvsGG, OR=0.595，95%CI=0.542-0.652, P0.001； AAvsGA+GG, OR=0.565，95%CI=0.489-0.652, P0.001）。2HLA-DPB1rs9277535与HBV感染及HBV自然清除的关系meta分析结果表明，携带HLA-DPA1

29、rs9277535A等位基因为HBV感染的保护性因素（OR=0.582，95%CI=0.556-0.609, P0.001），携带HLA-DPB1rs9277535A等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带HLA-DPB1rs9277535G等位基因个体的0.556倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同（AGvsGG, OR=0.542，95%CI=0.506-0.579, P0.00；AAvsGG, OR=0.371，95%CI=0.336-0.409, P0.00；GA+AAvsGG,OR=0.493，95%CI=0.462-0.525, P0.001；AAvsGA+GG, OR

30、=0.516，95%CI=0.472-0.564, P0.001）。携带HLA-DPB1rs9277535A等位基因的个体HBV自然清除的可能性高，发展成CHB的可能性降低（OR=0.663，95%CI=0.626-0.702, P0.001），为携带HLA-DPB1rs9277535G等位基因个体的0.663倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同（AGvsGG,OR=0.623，95%CI=0.570-0.681, P0.001；AAvsGG, OR=0.464，95%CI=0.412-0.523, P0.001；GA+AAvsGG, OR=0.577，95%CI=0.531-0.6

31、28,P0.001；AAvsGA+GG,OR=0.430，95%CI=0.390-0.474, P0.001）。 第一部分研究显示： 1在中国北方汉族人群中，HLA-DQ的两个SNP位点（rs9275572和rs2856718）与HBV的易感性，HBV自然清除及HBV感染后的相关疾病进展有关。rs9275572A和rs2856718G为HBV感染的保护性因素，在HBV自然清除、LC进展和HCC的进展中起到保护作用。2KIF1B rs17401966基因多态性与HBV自然清除有关联，携带rs17401966GG基因型的个体HBV自然清除的可能性更高，与HBV易感性、LC进展及HCC进展无关联。3

32、本研究未发现GAPT1rs33635和GAPT2rs974285两个SNP位点与HBV易感性、HBV自然清除及LC和HCC进展的相关性。4吸烟和饮酒均为HBV感染、HBV自然清除的独立危险因素；年龄越大，越容易由CHB进展到LC和HCC；男性、高龄及饮酒为HCC进展的独立危险因素；在HBV易感性、HBV自然清除及HBV感染不同结局中，存在基因-基因和基因-环境的交互作用。第二部分研究发现：1HLA-DQ多态性位点rs2856718与DNA应答无关联，与ALT应答具有相关性，rs2856718G等位基因可能为ALT应答的保护性碱基。性别是DNA应答和ALT应答的独立影响因素，女性更容易出现DNA

33、应答和ALT应答。2HLA-DQ多态性位点rs9275572与DNA应答及ALT应答有关，rs9275572A等位基因携带者DNA应答和ALT应答的可能性增高，性别和年龄为DNA应答的独立影响因素，性别为ALT应答的独立影响因素。3GSPT1rs33635C等位基因是DNA应答和ALT应答的保护性因素，女性DNA应答和ALT应答的可能性更高。4尚未发现GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的关联。5KIF1B rs17401966G等位基因为DNA应答和ALT应答的保护性碱基，性别和年龄为DNA应答的独立影响因素，性别为ALT应答的独立影响因素。6经MDR分析，LAM治疗

34、后的DNA应答和ALT应答不仅受到遗传因素的影响，同时又受到环境因素的影响，并存在基因-基因和基因-环境之间的复杂的交互作用。后面研究发现：1通过meta分析证实，携带HLA-DPA1rs3077A等位基因是HBV感染的保护性因素，携带此等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带rs3077G个体的0.556倍；而且还证明HLA-DPA1rs3077A等位基因为HBV自然清除的保护性因素，携带该等位基因的个体HBV自然清除的可能性更高。2通过meta分析证实，HLA-DPA1rs9277535A等位基因也是HBV感染和HBV自然清除的保护性因素，携带该等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带

35、HLA-DPB1rs9277535G等位基因个体的0.556倍；携带HLA-DPB1rs9277535A等位基因的个体HBV自然清除的可能性更高，发展成CHB的可能性降低。 目前由于关于HLAll类基因单核甘酸多态性与HCC易感性的报道仍然比较缺乏。但由于HBV持续感染和HCC有着明确的相关性，可以推测与HBV感染有关的多个SNP可能与HCC的发生也有相关性;另外，HCC一旦在机体内发生发展，机体的免疫系统可能通过多种途径参与抗肿瘤的免疫效应，以消除肿瘤细胞或控制肿瘤的生长，这其中也包括HLAll类分子所参与的对HCC细胞相关抗原的加工、处理和提呈及其他抗肿瘤机制，因此推测HLAll类基因的单

36、核甘酸多态性同样对HCC的发生、发展以及转移有着至关重要的作用。 参考文献1. GanemDPrineeAM:HePatitisBvirusinfeetionaturalhistoryandelinicaleonsequenees. NEnglJMed2004;350:1118一1129.2.LuFM，ZhuangH:ManagementofhePatitisBinChina.ChinMedJ(Engl)2009;122:33.LinTM， ChenCJ， WUMM， YangCS， ChenJS， LinCC， KwangTY， HsuST， LinS丫 HsuLC:HePatitisBvi

37、rusmarkersinChinesetwins.AntieaneerRes1989;9:737一741.4.CullenM，MalaskyM，HardingA，CarringtonM:High一 densitymaPofshorttandemrePeats acrossthehumanmajorhistocompatibilitycomplex.Immunogeneties2003:54:900一910. 5.HughesAL:Evolut ionofi ntronsande xonsofelass11majorhistocomPatibilitycomplex genesofvertebr

38、ates.Immunogeneties2000:51:473一86.6.JungMC，PapeGR:IInmunologyofhePatitisBinfeetion.LaneetInfeetDis20O2;2:43一50.7.Anisfeld A M, Kastwoelber H R, Meyerm E, et al. Syndecan-1 expression is regulated in an isoform-specific manner by the farnesoid-X receptorJ. J Biol Chem, 2003, 278 (22): 20420-20428.8.

39、Watanabem, Houtern Sm, Wang L, et al. Bile acids lower triglyceride levels via a path - way involving FXR, SHP, and SREBP-1cJ. J Clin Invest2004,113(10) :1408- 1418.9. Audrey Sirvent,Thierry Claudel, Genevieve Martin,et al.The farnesoid X receptor induces very low density lipoprotein receptor gene e

40、xpressionJ。 FEBS Letters,2004, 566 :173177.10. Stayrook KR,Bramlett KS,Savkur RS,et al.Regulation of carbohydrate metabolism by the farnesoid X receptorJ.Endocrinology,2005,146(3):984-991.11. Urizar NL,Dowhan DH,Moore DD,et al.The farnesoid X-activated receptor mediates bile acid activation of phosp

41、holipid transfer protein gene expressionJ.J Biol Chem, 2000,275(50):39313-39317.【研究方案】： 【研究目标】： 通过大样本量的病例一对照，以SNP为遗传标记，研究HLA一DPAI基因rS3O77A/G与慢性HBV感染及HCC的发病风险的关系。 .【研究内容】： 1). 在中国人群中对rs3077刀G与慢性乙型肝炎的遗传易感性进行验证; 2). 研究该多态与慢性HBV感染不同结局的关系; 3). 对该基因多态与HCC的遗传易感性进行分析; 4). 探讨该基因多态可能的作用机制。. 【研究方法】:一、应用聚合酶连反应(

42、polymerase chain reaction,PCR)和限制性片段长度多态性（restrition fragmeng length polymorphism,RFLP）,检测了417例慢性乙型肝炎患者、402例无症状慢性HBV携带者、453例肝癌患者以及表面抗原阴性的729例正常人群的rs3O77多态，比较不同基因型与上述疾病风险的关系。.【技术路线】：. 将所有研究对象分为四组：正常对照组，慢性乙型肝炎组，无症状慢性HIV携带者组，肝癌组。每个研究对象均捐献外周静脉血2ml以获取基因组DNA用于基因型分析。. 基因组DNA的提取(酚一氯仿抽提法):基因组DNA用蛋白酶K和饱和酚一氯仿常

43、规方法提取。将收集的抗凝血标本从20oc取出，置室温融化后转入另一洁净离心管，于5000xg离心巧min:弃上清，在下层血细胞中加入适量DNA裂解缓冲液(含 10mMpH8.0Tris一HCI，0.IMEDTA，20拼目mL胰RNA酶，0.5%SDS)，充分混匀后置37水浴lh，加入蛋白酶K(终浓度为100协留mL)，混匀后于37水浴过夜;加入等体积Tris一HCI平衡的饱和酚 (pH7.4)，充分混匀后于 8000xg离心巧min;转移上层水相至另一洁净离心管，加入等体积饱和酚:氯仿(1:1)，混匀后 8000xg离心巧min;转移上层水相至另一洁净离心管中，加入10%体积的乙酸钱溶液(10

44、M)和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置一 20oCZh;捞出沉淀的DNA并用75%乙醇洗涤两次，溶于适量Tris一EDTA(TE)缓冲液(含 10mMTris一HCI， 1mMED认， pH8.0):用紫外分光光度计测定DNA纯度及浓度。 . HLA一DPAI基因型分析 以蛋白酶K和饱和酚一氯仿常规方法提取基因组DNA。HLA-DPAI基因的单核普酸多态的基因型均以PCR扩增产物的限制性片断长度多态性 (PCR一RFLP)方法确定，具体描述如下: (1) PCR引物:扩增HLA-DPAI基因的3-UTR区含T/C多态的引物为rs3077F-GGA CTT AGG AGA GAT CTG AAC

45、 TCC A一3和rs3O77RS一 TCA GCA ATT CAG TCA GCC ACT CG一3，产物为102bp，其中rs3o77R引物的3端的倒数第二个C为错配碱基。 (2) PCR条件:25ul反应体系中含100ng模板DNA，0.1uM各引物， 0.2mMdATp、dGTp、dCTp和dTTp混合液，1UTaqDNA聚合酶及其lGel反应缓冲液。热循环条件为:95摄氏度预变性 2min，然后94摄氏度30sec，60摄氏度30Sec，72摄氏度30Sec，39个循环后72摄氏度延伸10min。 (3) 基因型分析:限制性核酸内切酶XhoI(New England Biolabs，

46、Ipswich，MA)用于T_C多态的基因型分析。酶切在10ul反应体系中进行,其中含8ulPCR产物、1乘以反应缓冲液和6U相应核酸内切酶。将反应混合液置37摄氏度水浴10h，限制性酶切产物在3.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶图像分析系统GDS一 8000(UVP， USA)分析电泳图谱，判断各基因型。T等位基因含一个双oI酶切位点，而C等位基因不含XhoI酶切位点，因此基因型只有一个 102bp片段，而TT基因型有78bp和24bp的两个片段，TC杂合子基因型有IOZbp、78bv和24bp的三个片段。 为保证基因分型的可靠性，基因分型实验在不知道标本是病人还是对照的情况下进行。此外，我们随

47、机挑选15%标本，由另一实验者进行重复检测，结果与第一次分析结果完全一致。同时，作为二等位多态，本研究中尽管针对T/C进行基因分型，由于文献中多以其互补链上的A/G对其多态进行描述，我们采取同样的方法。统计分析：组间频率的单因素分析如年龄、性别以及等位基因频率等以x才检验比较。以非条件Logistic回归模型，对年龄和性别进行校正后，计算比值比(odds ratios，ORs)及其95%可信区间 (Cls)及基因型差异的值。所有统计检验均为双侧概率检验，以P0.05为统计学显著性差异标准。所用统计软件为StasticAnalysis system612版 )。同时计算正常对照组的基因型频率是否

48、符合Hardy一einberg平衡定律。5. 【预期成果】： rs3077多态位点的基因型在病例组和对照组间的分布符合Hardy一Weinberg平衡定律。rs3O77一A等位基因显著降低了慢性乙型肝炎的发病风险，且呈等位基因一剂量效应。进一步分析显示，该等位基因同样降低了无症状HBV携带者、HBsAg阳性的肝癌及总体肝癌的发病风险，且同样呈等位基因一剂量效应。然而，该等位基因与HBsAg阴性的肝癌发病风险不相关，也与无症状HBV携带者进展为肝癌的风险无明显相关性，却反而促进了慢性乙型肝炎进展为肝癌的发病风险。6. 【研究计划】：1）订购实验材料及试剂如：Tris碱,SDS ，胰RNA 酶，Taq DNA 聚合酶， dNTP ，Xhol，琼脂糖；准备相关实验仪器。 2) 选择合适的研究对象，包括正常对照者、慢性乙型肝炎患者、无症状 慢性HIV携带者、肝癌患者，收集血标本保存待用于检测。 3）基因组DNA的提取(酚一氯仿抽提法)，及进行HLA一DPAI基因型分 析。 4）进行统计学分析。7. 【实验条件与基础】：实验条件：主要试剂有：Tris碱,SDS ，胰RNA 酶，Taq DNA 聚合酶