本科毕业设计---山羊褪黑激素受体1a基因hinfⅰ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析.doc
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1、华中农业大学本科毕业论文(或设计)本科毕业论文题 目:山羊褪黑激素受体1A基因Hinf酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析姓 名:学 号专 业:动 物 科 学指导教师:职 称分类号 密级华中农业大学本科毕业论文 山羊褪黑激素受体1A基因Hinf酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析Hinf-RFLP of Melatonin receptor 1 A(MTNR1A) gene and the association with the litter size traits in goat目 录摘 要4ABSTRACT5前 言61.材料与方法71.1 材料71.1.1 试验动物71.1.2 实验材料
2、71.1.3主要试剂的来源71.1.4主要仪器设备81.1.5主要试剂的配置81.1.6主要分子生物学软件101.2 方法101.2.1.山羊基因组DNA的提取101.2.2.引物设计及其序列101.2.3.PCR扩增及其电泳检测111.2.4. 限制性内切酶消化扩增产物以及电泳检测131.2.5.统计分析142 结果与分析152.1 PCR扩增结果152.2酶切结果152.3 褪黑激素基因频率和基因型频率分析结果162.4 MTNR1A基因型与波尔山羊头胎产羔数性状的关联分析172.5 MTNR1A基因型与经产产羔数性状的关联分析173 讨论1831 不同山羊品种基因型频率及基因频率差异18
3、32 MTNR1A不同基因型对波尔山羊头胎和经产羔数的影响18参考文献19致 谢20山羊褪黑激素受体1A基因HINF酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析摘 要本研究以褪黑激素受体1A 基因为候选基因,分析该基因多态性对山羊产羔数性状的影响。采用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length polymorphism, PCR-RFLP)方法,检测了65只波尔山羊和51马头山羊褪黑激素受体1A基因Hinf酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析。结果表明,褪黑激素受体1A基因在波尔山羊中存在Hinf酶切多态性,而在马头山羊样本中则无多态性。在波尔山羊中,检测到AA、GG
4、两种基因型,未检测到AG型;其中AA基因型个体在出现频率最高,为0.554,GG型为0.446;A、G等位基因频率分别为0.554和0.446。性状关联分析结果表明:波尔山羊的AA基因纯合型头胎平均产羔数比GG基因杂合型多0.07只,加性效应值为0.035,显性效应值为-1.42;经产羔数的AA型比GG型多0.09只;加性效应值为0.046,显性效应值为-1.84。A等位基因可能与波尔山羊产羔数呈正相关,该位点主要以加性方式起作用。关键词:山羊;繁殖性状;褪黑激素受体;PCRRFLPHinf-RFLP of Melatonin receptor 1 A(MTNR1A) gene and the
5、 association with the litter size traits in goatAbstractIn the present study, Melatonin receptor 1 A gene (MTNR1A) was analysed to find the assocation with litter size in goat as a candidate gene. Hinf-RFLP (Restriction Fragment Length polymorphism, RFLP) of MTNR1A was found in 65 Boer goats and 51
6、goats Ma Tou. No polymorphism was detected in Ma Tau goats . Two genotypes AA, GG were found in Boer goats. The frequency of AA genotype was higher than GG genotype, which were 0.554 and 0.446, respectively. The allele frequencies for A and G were 0.554 and 0.446. The results of traits association a
7、nalysis showed that individuals with AA genotype had additional 0.07 average litter size at first kidding in Boer Goat. The additive effect value was 0.035, while the dominant effects value -1.42. Moreover, AA genotype had additional 0.09 average litter size for multiparity, the additive and dominan
8、t effects value were 0.046 and -1.84, respectively. Allele A was possiblely positively correlated with litter size in Boer goats. The additive effect was dominant at the site.Key words: Goat; Reproductive traits; MTNR1A; PCR-RFLP前 言褪黑激素主要是由松果体合成的,其它合成部位还有:视网膜、眼眶腔的副泪腺、唾液腺、肠的嗜铬细胞及红细胞,松果体把对外界光照形成的神经信息经
9、下丘脑视交叉上核转变成体液信息MEL。1.褪黑激素生理功能、作用机制;褪黑激素对生殖系统作用的机理主要是通过光作用于视网膜,然后通过视网膜- 下视丘至视交叉上核,再经过一系列复杂的神经交换至颈上神经节,其节后交感神经作用于松果体。松果体分泌褪黑激素,通过下丘脑垂体性腺轴影响生殖系统。褪黑激素对生殖系统的作用因动物种类、生理状态不同而表现出抑制、促进或无作用的多重性(焦传珍,2005)。多项研究结果表明,褪黑激素虽然对牛、鼠类、禽等动物和人的生殖系统的发育有抑制作用,但是对绵羊、山羊、鹿等动物则明显表现出促进作用。2褪黑激素受体类型、作用机制;褪黑激素受体属于G蛋白耦联受体家族。根据其分子生物学
10、方法又可分为MTNR1A、MTNR1B、MTNR1C三种亚型(张凯等,2006)。目前在哺乳动物中还没有发现MTNR1C受体,而具有明显季节性繁殖特征的动物仅在垂体结节部发现MTNR1A受体,提示垂体结节部可能是褪黑激素繁殖效应的作用位点。3褪黑激素受体分子标记在其它动物中的研究进展目前国内外对绵羊M TNR1A 基因已经有所研究已经很多了。Messer等(1997)参考文献中未列出和Notter等(2003)用M n l和R sa酶分别对白面杂种羊、萨福克羊、特克塞尔羊、柯泊华斯羊和合成系绵羊群体M TNR1A 基因外显子2 的824 bp扩增产物进行消化,发现M n l在5 个绵羊群体中都
11、存在286 bp和236 bp多态片段, R sa都存在295 bp 和290 bp 多态片段。Pelletier等(2000)用M n l限制性内切酶消化2组发情行为有明显差异(常年发情和季节性发情)的Merinos dArles母绵羊以及季节性发情明显的Ile2de2France 母绵羊M TNR1A基因外显子2的824 bp扩增产物,发现存在303 bp和236 bp 多态片段。季从亮等(2003)和Chu等(2003)用M n l和R sa对常年发情的小尾寒羊和湖羊以及季节性发情的多赛特羊和萨福克羊共146只绵羊M TNR1A 基因外显子2的824 bp 扩增产物进行PCR-RFLP多
12、态性分析,发现M n l在4个绵羊品种中都存在303 bp和236 bp多态片段, R sa都以上迹象表明,这是直接从网上下载的。存在290 bp和267 bp 多态片段。在绵羊中的研究结果表明,该基因对绵羊繁殖性能存在影响。但是,对于山羊,只有对产绒或营养调控的研究,目前尚未发现有对山羊繁殖性能影响的相关报道。4本实验目的意义本实验室滑国华等(2006)在山羊MTNR1A中共发现7个SNPs,对其中4个SNPs分析结果显示:MTNR1A不同基因型对山羊产羔数性状有一定的影响。为进一步研究该基因对山羊产羔数性状的影响,本试验选取G493A突变位点,采用引入酶切位点方法,即限制性片段长度多态性F
13、orced PCR-RFLP(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphsim),分析该位点在马头山羊和波尔山羊中的分布情况,并分析该位点对波尔山羊产羔数影响,为山羊标记辅助选择提供理论依据与滑国华的区别?更确切地说,创新点?或特色?。1.材料与方法1.1 材料1.1.1 试验动物 马头山羊51头,采自湖北省十堰市;波尔山羊65头,采自湖北省宜都市波尔山羊种羊场。颈静脉采血10ml/只,EDTA抗凝,-20保存。1.1.2 实验材料 1.5ml Eppendorf管、双面板、微量移液枪(1000l、200l、4
14、0l、10l、2.5l)及枪头、 一次性PE塑料手套。1.1.3主要试剂的来源TagDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司;DNA限制性内切酶Hinf购自晶美生物工程有限公司;分子量标准100bp DNA Ladder和PBR322DNA/MspI购自上海生工生物工程技术有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、苯酚、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS)、甲酰胺、丙烯酰胺(Acrylamide,Acr)、NN亚甲基丙烯酰胺(Bisacrylamide)、琼脂糖、溴化乙锭(EB)、琼脂糖、乙二胺乙二酸二钠盐(EDTANa2)等均购自武汉凌飞科技有限公司。1.1.4主要仪器设备表1 主要仪器设备
15、Table 1 Laboratory equipment and instruments仪器设备名称型号生产厂家电热恒温水浴锅GD120英国Grant公司台式离心机TGL-16G上海安亭科学仪器厂梯度PCR仪T1 Thermo cyler德国Biometra公司冷冻离心机Centrfuge 5810德国eppendorf公司恒温摇床HS80中国科学院武汉科学仪器厂自动双重纯水蒸馏器SZ-93上海亚荣生化仪器厂紫外分析仪UV-IV北京市新科技应用研究所电泳槽DYY-III北京六一仪器厂稳压稳流电泳议DYY-2北京六一仪器厂手提式高压灭菌锅YXQ-SG46-280A上海博讯实业有限公司医疗设备厂超
16、纯水仪WaterPro美国LABCONCO公司移液器1ml;200l;40l; 10l;2.5l芬兰Labsystems公司1.1.5主要试剂的配置1.1.5.1用于血液样品采集的溶液的配制1) 1M Tris.cl储备液:称取121.4g Tris碱溶于800ml双蒸水中,加浓盐酸调至pH=8.0,定容到1000ml。高压灭菌,室温保存;2) 0.5M EDTA(pH=8.0):称取186.1g Na2EDTA2H2O溶于800ml双蒸水中,加入NaOH(约20g)调至pH=8.0,定容到1000ml。高压灭菌,室温保存;3) 10%SDS:称取50g SDS加热溶于400ml双蒸水中,定容
17、至500ml。高压灭菌,室温保存;4) 抗凝剂(0.2MEDTA):量取200ml 0.5M EDTA加入双蒸水定容至500ml。1.1.5.2 用于基因组DNA提取的溶液的配制1) 蛋白酶K:称取200mg蛋白酶K溶于10ml双蒸水,以1ml分装,-20冷冻保存;2) 氯仿/异戊醇(24:1):量取480ml氯仿,加入20ml异戊醇,混匀;3) 3M NaAc:称取NaAc3H2O溶于400ml双蒸水中,用HAc调至pH=5.2,加水定容至500ml。高压灭菌,室温保存;4) TE缓冲液:100mM Triscl(pH8.0),1mM EDTA(pH8.0)。1.1.5.3 用于琼脂糖凝胶电
18、泳及检测溶液的配制1) 50TAE储备液: 称取242g Tris碱溶于750ml双蒸水中,加入57.1ml HAc、100ml 0.5M EDTA(pH8.0),加水定容至1000ml;2) 5TBE储备液:称取54g Tris碱和27.5g硼酸溶于750ml双蒸水中,加入20ml 0.5M EDTA(pH8.0),加水定容至1000ml;3) 6上样缓冲液:0.25%溴酚兰,0.25%二甲苯青,15%Ficoll聚蔗糖;4) 溴化乙锭(EB,10mg/ml):100ml双蒸水中加入0.1g EB,搅拌使完全溶解,转入棕色试剂瓶,锡箔包裹。1.1.5.4 用于聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的溶液的
19、配制1) 30% 丙烯酰胺(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺29:1):700ml双蒸水中加入290g丙烯酰胺,10g甲叉双丙烯酰胺,搅拌使完全溶解,加水定容至1000ml,4保存;2) 10% 过硫酸铵:称取1g过硫酸铵溶于8ml双蒸水,定容至10ml;3) 10% 乙醇:量取50ml无水乙醇溶于450ml水中,混匀;4) 1% HNO3:量取15ml浓HNO3溶于985ml双蒸水中,混匀;5) 0.2% AgNO3:称取1g AgNO3溶于500ml双蒸水中,置于棕色试剂瓶;6) 3% Na2CO3(0.05%甲醛):称取30g无水Na2CO3溶于900ml双蒸水中,加入1.5ml甲醛,定容至10
20、00ml;7) 3% HAc:量取30ml冰HAc溶于970ml双蒸水,混匀。1.2 方法1.2.1.山羊基因组DNA的提取从山羊颈静脉采血10ml,放入装有抗凝剂(0.5mol/L EDTANa2)的离心管中,6000r/min离心15min,弃上清,吸取白细胞沉淀(参杂少量红细胞)于另一离心管中;加入两倍体积双蒸馏水(灭菌),摇匀沉淀,静置10min15min,破碎红细胞;6000r/min离心15min,轻轻弃去上清,留白细胞沉淀;加入1SET 5ml,蛋白酶K(10mg/ml)0.1ml至终浓度200ng/ml,10% SDS 250l至终浓度0.5%,55水浴消化过夜;加入等体积饱和
21、平衡酚轻轻摇匀,12000r/min离心15min,轻轻吸取上层水相于另一离心管中,弃下相苯酚;重复上步;加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻摇动10min,12000r/min离心15min,轻轻吸取上层水相于另一离心管中,弃下层有机相;加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),轻轻摇动10min,12000r/min离心15min,轻轻吸取上层水相于另一离心管中,弃下层有机相;加入两倍体积预冷无水乙醇,轻轻转动管子,DNA呈絮状析出,用1ml吸头(灭菌)吸出DNA沉淀,放入1.5ml离心管中,加入预冷无水乙醇洗涤一次,离心弃去无水乙醇,再用75%乙醇漂洗2次,小心吸去乙醇,待DN
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