一种通用的质粒构建方法的探索-李曼(完整版)实用资料.doc
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1、一种通用的质粒构建方法的探索_李曼(完整版)实用资料(可以直接使用,可编辑 完整版实用资料,欢迎下载)质粒构建技术是基因工程常用的技术之一,即将一段需要克隆的外源DNA片段插入到载体DNA分子中形成重组DNA分子,然后将该重组载体转运到宿主细胞中1,2,常规质粒的构建方法是在插入片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点,即双酶切后可以产生相同的粘性末端3,4。本方法克服了这个局限性,通过利用BsaI酶切特点实现了载体与插入片段的无缝连接。本实验以载体pKH和DNA片段CP(一种蛋白质内含子的编码基因为例介绍这种通用并且简便的质粒构建方法。1材料与方法1.1材料以质粒pKH作为构建质粒的载体,pMC
2、P 含有编码CP的基因。质粒pKH(3516bp和pM CP来自加拿大DalhousieUniversityPaulLiu教授实验室,含有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因,常被用来作为分子生物学试验的载体。本实验中所选择的pKH的插入位点位于卡那霉素抗性基因中(图1。1.2引物设计与合成图2(A展示了BsaI酶切位点,它的识别序列与切割序列不一致,它在识别序列后的第一位碱基和互补链的第五位碱基切割。在载体的插入位点处设计一对含有BsaI 酶切位点的引物,对载体进行反向PCR,引物5端加上BsaI酶切序列和保护碱基,另外还需要补充目的片段末端的四个碱基。在本实验中,对载体pKH进行反向PCR
3、 设计的引物为pKHA和pKHB(图2中B,从53依次是保护碱基(ATC,BsaI酶切序列(阴影部分,插入片段C P 端的四个碱基(小写部分,以及与载体互补序列(划线部分。对插入片段扩增的一对引物包括保护碱基,BsaI 酶切序列以及与插入片段互补的序列。如图2(C所示,本实验用于PCR 扩增C P 的引物C P b 1和C P b 2包括了保护碱基(ATC,BsaI酶切序列(阴影部分,插入片段互补序列(划线部分。1.3环形载体质粒和插入片段制备对回收的反向P C R 产物磷酸化后自连,转化感受态细胞,涂含有100?g /mlAmp的LB平板,37培养12h,挑取单克隆,在含有100g/mlAm
4、p的液体LB培养基中培养,150r/min,37培养12h,提取质粒pKH。BsaI酶切验证环形载体pKH的正确性,并对酶切正确的质粒测序。BsaI酶切环形载体便可获得用于质粒构建的线性载体。对PCR扩增的CP片段也利用BsaI酶切,获得插入片段。1.4获得重组质粒所获得的载体与插入片段具有相同的粘性末端,用T4DNA连接酶连接即可获得重组质粒。2结果2.1环形载体获得通过含有BsaI引物反向PCR质粒pKH,然后磷酸化,自连,转化感受态细胞获得环图2BsaI酶切序列和PCR中引物序列Fig.2therestrictionsiteofBsaIandsequencesofprimersforPC
5、R一种通用的质粒构建方法的探索李曼(东华大学生物科学与技术研究所上海202120摘要:P C R 产物与克隆载体连接是基因克隆环节中重要的一步。文章介绍了一种简便、通用的质粒构建方法。此法是在P C R 引物设计时,在目的片段5端加上BsaI序列,然后通过B s a I酶切产生具有相同粘性末端的载体和插入片段,经过连接,获得重组质粒。关键词:质粒构建反向PCRBsaI无缝连接中图分类号:Q 782文献标识码:A 文章编号:1674-098X(202104(b-0085-02AUniversalthroughputMethodofConstructingPlasmids(InstituteofB
6、iologicalSciencesandBiotechnology,DonghuaUniversity,Shanghai202120,China Abstract:Thearticledescribesasimpleandthroughputmethodtoconstructplasmid.ThemethodistoaddthesequenceofBsaIto 5primerend,producingvectorsandinsertswiththesamecohesiveterminusbyBsaIdigestion,andatlasttogetrecombinantplasmids byli
7、gation.Keywords:plasmidconstruction;reversePCR;BsaI;Seamlessligation图1载体pKH 和插入位点Fig.1theplasmidpKHandinsertsiteinthestudy图4酶切获得的载体和插入片段 Fig.4VectorandInsertbydigestion 图3BsaI 酶切验证环形载体 Fig.3IdentificationofcirclevectorbyBsaI digestion(下转87页绥中滨海开发区GPS网点与国家各级控制点重合14个,为充分利用原有控制点的标石,新埋设控制点48个。3.2GPS控制点的
8、观测此次控制网按照城市测量规范及GPS测量规范要求共观测64点,其中联测三角点10个,水准点4个,共观测188条基线,其中有45条复测基线,最大边长为6760.333m,最短边长为2162.347m,布网方式采用边点混合联接方式。G P S观测采用静态定位模式进行作业,观测要求应满足CJJ73-97有关规定。观测时,应视卫星信号情况、点位环境和基线长度等因素的影响,必要时适当延长观测时间。正确量取并记录天线高。G P S四等控制点均须按CJJ73-97要求测绘点之记。4GPS控制网数据处理及精度评定基线向量解算和网平差采用随机软件Solution2.6进行。基线向量解算首先进行自动处理,若处理
9、结果不理想,则进行基线的精化。解算时全部解算出整周模糊度, 188条基线均得到双差固定解。4.1GPS网在WGS-84坐标系下的无约束平差基线解算合格后,对所有独立基线组成的闭合图形,以三维基线向量及相应方差协方差阵作为起算数据,进行GPS网的无约束平差。无约束平差是为了检查网内有无粗差基线,考察GPS网的内符合精度以及基线向量之间有无明显的系统误差,方差因子是否符合客观实际精度。因此,无约束平差反映了G P S网的真实精度。无约束平差提供各控制点在WGS84坐标系下的坐标,各基线向量三个坐标观测值的总改正数,基线边长和边长精度信息。三维无约束平差中,基线向量的改正数绝对值均不大于3的限差要求
10、(如表1、表2。4.2在北京54坐标系下的约束平差约束平差是对通过了预处理和无约束平差各项检核后的GPS向量网,在多个固定点的约束下进行平差计算。绥中县GPS控制网的约束平差采用在54坐标系下的三等以上控制点进行平差,在本次平差过程中,发现若将四等三角点打渔场纳入到起算点,则计算出的其他点的坐标和提供的坐标值就相差达20米,并且会出现红边,如果除去打渔场这个起算点后,推算的其坐标值和提供的坐标值也不相符,并且三等点台子南、二等点万宝山、大石山、止锚湾作为起算点约束后,解算过程也会出现红边,若将这四个点解除约束后则平差可以通过。由此推断,打渔场控制点很可能和其他控制点不在一个网中,而台子南、万宝
11、山、大石山、止锚湾是精度不够,故平差过程采用活龙山、费家岭、霍家沟、荆条楼、金牛山、东沙窝等六个点进行平面约束。求得中央子午线为120o的高斯平面直角坐标。在约束平差过程中,二维约束平差中,基线向量的改正数与无约束平差结果的同名基线相应改正数的较差均满足2的限差要求(如3、表4。4.3高程拟合绥中县GPS网的部分点位高程采用四等水准施测,起始点为国家一等水准点沈山70,沈山65。由地面的GPS点位组成四等水准网,总计敷设三条水准路线,共计14个点。四等水准网全路线长96.2k m,由两条闭合水准路线和一条附合水准路线组成。四等水准网平差采用间接平差方法,由清华山维平差软件进行解算,平差结果为:
12、环路线的最大闭合差为22mm,最小为2mm,观测中误差2.2mm,最大点位误差8.7mm,最大点间误差6.2mm,结果表明精度良好,符合规范要求。高程拟合时采用GPS网中联测了水准点的高程平差值作为高程已知点进行平差拟合,得到四等GPS点的高程平差值。5结语绥中县的GPS网控制范围大,网形设计合理,点位密度符合规范要求,约束的平面控制点达6个,用于高程拟合的水准点也有14个,这样就保证了有足够的起算数据来约束整个控制网,使得整个网的精度得到了很大的提高。最后的精度评定表明绥中GPS网的精度远高于所要求的四等网的测量精度。采用GPS技术布设的控制网精度高,而且不受人为因素的影响,也不受环境和距离
13、的限制,最大程度上减少了累计误差。尤其是在地形条件复杂的地区更具优势。本测区在控制面积大、时间紧的具体情况下,采用了GPS技术建立的控制网观测仅用了12天。充分说明了GPS测量技术具有精度高、效率高、费用小的特点。绥中县的GPS控制网不仅能及时准确的为城市规划、市政建设和土地管理提供测绘保障,而且新网中有一部分点是原来的老网中的网点,有效的将老网成果整合到新网中来,不仅使新网和老网的基准得以统一,还使成果得以通用,提高了效益。GPS高程拟合也是GPS测量的一个重要领域,特别是在地形复杂的山地,由于这些地区的地形条件的限制,使得常规的水准测量难以实施,在有足够的水准点作为已知高程点时,采用了与测
14、区高程异常相吻合的拟合方法,GPS高程测量同样可以达到很高的精度。参考文献1马祥.GPS技术在黄山风景区航测数字化测图中的应用J.城市勘测,2021(1:7881.2王建津.建立GPS平面控制网的几个问题J.岩土工程勘测,2005(2:3135.3于立国,毛继军.G P S技术在高等级城市控制网中的应用J.测绘通报,2005(9:2628.4徐绍铨,张华海,杨志强,王泽民.G P S测量原理及应用M.武汉大学出版社,2005.5徐长松.GPS技术在廊坊市城市测量控制网中的应用J.华北矿业高等专科学校学报,2000(6.形载体,利用BsaI酶切可初步验证其正确。如图3所示,泳道1为阳性对照(35
15、16bp环形载体pKH由于含有了BsaI酶切位点,经过BsaI酶切、电泳,呈现线性DNA的条带(泳道3和4,3520bp,而原始pKH不含有BsaI,表现为质粒条带(泳道2和5。2.2酶切环形载体和插入片段对获得的环形载体和扩增的CP均用BsaI 酶切,可获得含有相同粘性末端的载体和插入片段(图4阴影部分为酶切后获得片段。两者连接便可获得重组质粒,这样利用了BsaI酶切的特点,使插入片段和载体达到了无缝连接的目的。3讨论利用此法构建质粒具有以下优点:其一,常规的质粒构建,需要寻找合适的酶切序列,使插入片段和载体具有相同的粘性末端,而利用这种方法只需要通过PCR引入BsaI序列,酶切便可产生相同
16、粘性末端,具有更好的通用性和简便性1,5;其二,如果需要制备大量的载体,这种方法也具有显著优势。由于利用含有BsaI序列的引物反向P C R,然后磷酸化,自连,转化,液体培养菌体,可获得大量的环形载体,然后再利用BsaI酶切就可获得大量线性载体片段。与反复通过反向PCR获得载体的策略相比更高效,准确率也更高6,7,8。需要注意的是,对于一些本身含有BsaI酶切位点的载体,首先需要把BsaI酶切位点突变,然后利用本策略。总之,利用BsaI无缝连接的方法是一种简便、通用、高效质粒构建方法。致谢:感谢我的导师孟清教授的悉心指导和加拿大D a l h o u s i e U n i v e r s i
17、 t y,PaulXiang-QinLiu教授提供实验材料。参考文献(References1TennoT,GodaN,TateishiY,TochioH,MishimaM,HayashiH,ShirakawaM,HiroakiH.High2throughputconstructionmethodforexpressionvectorofpeptidesforNMRstudysuitedforisotopiclabeling.ProteinEngDesSel,2004,17(4:305314.2MaoChunsheng,JingNinyi,GuWanjun.Auniversalhigheffic
18、ientmethodofblantendsubcloning.Chem-istryofLife,1995,15(5:4243.3陆云华,马立新.一种通用高效的复杂载体构建的新方法,2006,28(2:212218.4毛春生,金宁一,顾万钧.一种高效率通用的平端亚克隆方法.生命的化学,1995,15(5:4243.5欧阳平,李玉.一种载体构建的新方法:一步克隆法.湖北大学学报(自然科学版,2007,29(2:178181.6郑高阳,刘晓颖,王振英.T载体构建及其构建过程中常见问题的处理方法.2021,1(2:116117.7JosephSambrook,DavidWRussell.Molecul
19、arCloning:ALaboratoryManual.3rded.ColdSpringHarborLabortoryPress.2001,8795.8YangYS,WatsonWJ,TuckerPW,etal.ConstractionofrecombinantDNAbyexonucleaserecessionJ.NucleicAcidsRes,1993,21:1889-1892.(上接85页一种基于小波的图像降噪方法张 静1 孙 俊2(1江苏科技大学电子信息学院 江苏 镇江 212003 (2江苏大学电气信息工程学院,江苏 镇江212021摘要:通过对图像的小波变换系数进行阈值操作,可有效降
20、低噪声,但还是保留一些噪声。Wiener 滤波是一种线性滤波方法,用小波阈值方法结合Wiener 滤波,可进一步对图像噪声进行降噪。实验结果表明小波阈值Wiener 滤波方法是一种有效的图像降噪方法,其在图像恢复上和人眼视觉上都优于小波阈值方法。关键词:小波变换;wiener 滤波;软阈值;图像降噪;Mallat 算法文献标识码:A 中图分类号:TN911.71 引 言图像一般都会受到噪声的影响,由于噪声影响图像的输入传输、输出等环节,使得图像分辨率下降,同时破坏了图像的精细结构,给图像的后续处理(图像二值化操作和图像特征提取带来不便,因此如何有效抑制噪声已成为图像处理中极重要和首要的任务。图
21、像降噪的目的是提高图像的信噪比,突出图像的应用的特征1。小波图像降噪已被视为图像处理中的重要降噪算法,是基于噪声和信号在频域上分布不同而进行的,一般信号和噪声分别分布在低频区域和高频区域,图像的细节也分布在高频区域。小波变换是一种调和变换,其同时具有空间域和频域的局域性,其具有多分辨分析的性质,能适应信号频率的局域变化,在每一层小波分解上选取各自阈值,可以消除多数噪声。在MSE 意义上,最优信号估计是wiener 滤波器,Wiener 滤波在信噪比较高的图像去噪中效果更好,所以基于小波降噪后的图像,进一步应用wiener 滤波降噪,可达到更好的去噪,并且这种综合降噪方法能在保护细节之间取得较好
22、的效果6。2 图像小波分解23二维图像信号通常可用二元函数(,(22R L y x f 表示,对于二元函数,有相应的二维小波变换和多尺度逼近。设(,(22R L y x f ,(y x 满足容许条件+=0,(dxdy y x ,称积分dxdy a b y a b x a y x f b b a W f ,(1,(,(2121=+ 为,(y x f 的二维连续小波变换,其中,(y x 为二维小波函数。与此对应的小波变换的重构公式为21212103,(,(1,(db db a b y a b x b b a W a dac y x f Rf =+。将二维连续小波变换公式中的参数a、b 进行适当的离
23、散化:am b al b a j=21,2,则可得到离散型小波变换:dxdy m y l x y x f m l j W j j R j f 2,2(,(2,(2=。小波变换是一种时窗和频窗都可改变的时频局部化分析方法,这正是区别于傅立叶变换的优点,在低频部分取宽的时(空间窗,利用分析缓慢变化的信号,在高频部分取窄的时(空间窗,可精确定出突变信号位置,所以小波变换能自适应的从信号中提取信息。为了提高二维图像小波变换的运算速度,一般采用离散小波变换的快速算法Mallat 算法,相当于分别对图像数据的行和列作一维小波变换。如图1为图像三次小波变换后的分解图,小波变换的结果是原始信号在一系列高频带数
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