实验五：洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片的制作雨观察优质资料.doc

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1、实验五：洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片的制作雨观察优质资料(可以直接使用，可编辑 优质资料，欢迎下载）实验五：洋葱鳞片叶内表皮细胞临时装片的制作与观察教学设计一、实验目标1.概述植物细胞的基本结构，明确植物细胞各部分结构和功能。2.尝试制作临时装片，并使用显微镜观察自己制作的临时装片。3. 通过实验，培养学生制作临时装片的能力和进一步操作显微镜的能力。二、教学重点和难点1、重点：制作洋葱鳞片叶表皮细胞的临时装片，使用显微镜观察洋葱细胞。2、难点：制作洋葱鳞片叶表皮细胞的临时装片。三、实验准备1、实验材料准备：载玻片、盖玻片、清水、纱布、滴管、镊子、吸水纸、解剖针、碘液、较大的洋葱、显微镜，刀片等

2、。四、教学流程图情景引入 学生检查实验器具教师示范并讲解操作过程学生分组实验观察植物细胞结构绘图教师巡回指导讨论分析实验中问题填写实验报告师生归纳总结五、教学过程一、洋葱鳞片叶表皮细胞的临时装片的制作及观察。（一）检查材料器具是否完好齐备并复习显微镜的使用。（二）教师示范操作（同时讲解操作要点）擦：用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净。滴：把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。（滴水不能太多也不能太少）撕：把洋葱鳞片叶切划成边长约0.5cm的正方形，用镊子从鳞片叶的内侧撕下一小块透明的薄膜。展：把撕下的薄膜放在载玻片中央的水滴中，用解剖针或镊子轻轻地把它展平。盖：用镊子夹起盖玻片

3、,轻轻地盖在表皮上。盖时,让盖玻片的一边先接触载玻片上水滴的边沿,然后慢慢放下,以免产生气泡。染：在盖玻片的一侧滴一滴碘液（用红墨水也可以染色）吸：用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，重复23次，使碘液浸润标本的全部。（三）学生分组实验（2人一组），教师巡回指导。（四）学生观察自己制作的洋葱鳞片叶表皮细胞的临时装片。（五）练习绘制洋葱细胞结构简图，填写实验报告。二、讨论交流分析归纳总结, 教师对小组制作情况做简单的评价。小组交流各自实验过程中遇到的问题，并解决。撕染盖展擦滴吸最后得出：洋葱表皮细胞临时装片的制作过程：三、多媒体出示：植物细胞结构图。让学生和自己所观察到的植物细胞的结构做一对比，认清植

4、物细胞的各部分结构及细胞各部分结构的作用和功能。细胞质：具有流动性，内部包含一些细微结构（如：叶绿体、线粒体、液泡等）。叶绿体：植物细胞进行光合作用的场所。液泡：内含细胞液，溶解着多种物质。四、归纳总结制作洋葱表皮细胞临时装片的过程；植物细胞的基本结构及各部分结构和功能。新课教学一、洋葱鳞片叶表皮细胞的临时装片的制作及观察。（一）检查材料器具是否完好齐备并复习显微镜的使用。（二）教师示范操作（同时讲解操作要点）擦：用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净。滴：把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。（滴水不能太多也不能太少）撕：把洋葱鳞片叶切划成边长约0.5cm的正方形，用镊子从鳞片叶

5、的内侧撕下一小块透明的薄膜。展：把撕下的薄膜放在载玻片中央的水滴中，用解剖针或镊子轻轻地把它展平。盖：用镊子夹起盖玻片,轻轻地盖在表皮上。盖时,让盖玻片的一边先接触载玻片上水滴的边沿,然后慢慢放下,以免产生气泡。染：在盖玻片的一侧滴一滴碘液（用红墨水也可以染色）吸：用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，重复23次，使碘液浸润标本的全部。总之,要做的“玻片要干净，水要滴的少，表皮要撕的小，毛面要朝上，盖玻片要斜放，染色多重复，观察要规范”。（三）学生分组实验（2人一组），教师巡回指导。（四）学生观察自己制作的洋葱鳞片叶表皮细胞的临时装片。（五）练习绘制洋葱细胞结构简图，填写实验报告。二、讨论交流分析归纳

6、总结, 教师对小组制作情况做简单的评价。小组交流各自实验过程中遇到的问题，并解决。撕染盖展擦滴吸最后得出：洋葱表皮细胞临时装片的制作过程：三、多媒体出示：植物细胞结构图。让学生和自己所观察到的植物细胞的结构做一对比，认清植物细胞的各部分结构及细胞各部分结构的作用和功能。细胞壁：保护和支持作用。细胞膜：保护、控制物质的进出。细胞核：含有遗传物质。细胞质：具有流动性，内部包含一些细微结构（如：叶绿体、线粒体、液泡等）。叶绿体：植物细胞进行光合作用的场所。液泡：内含细胞液，溶解着多种物质。学生检查认真观察让学生区分叶的内外两侧，并注意是从内侧取的。注意不是同一侧。学生实验观察学生绘图交流提出问题，讨

7、论分析，总结。对比，学习联系生活实际中的果汁等。激发了学生进一步探究的欲望让学生从实验中感到乐趣，学到知识提高观察能力提高生物简图绘画能力整理归纳学以致用小结师生共同归纳总结。制作洋葱表皮细胞临时装片的过程；植物细胞的基本结构及各部分结构和功能。学生小结提高归纳总结及表达能力布置作业 绘制植物细胞结构简图， 填写本次实验的实验报告。【教学过程】【板书设计】 8.1生物体的基本结构撕染盖展擦滴吸一、洋葱鳞片叶表皮细胞的临时装片的制作过程：二、植物细胞的结构及功能：细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、叶绿体等【问题研讨】1、为了防止撕下的洋葱鳞片叶表皮薄膜发生卷曲,以及展平时的方便,在撕取洋葱鳞

8、片叶内表皮时先拿刀片划0.5cm左右的方块，再用镊子取出。病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求.1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1。1。1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体,与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面,Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代

9、细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。1。1。2特点1） 直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞).2） 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。3） 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。4） 无需任何转染试剂，操作简便。5） 可以根据客户需要制备多种标记。1。1.3慢病毒包装简要流程：1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞2

10、93T等。 3） 培养 48hrs 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4） 病毒的纯化和浓缩。 5） 分装、 80 保存. 6） 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。1.2、腺病毒1。2.1原理腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。1。2.2特点1） 几乎可以感染所有类型的细胞2） 可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺

11、失) 的腺病毒3） 病毒滴度高,产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。4） 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单.5) 感染细胞时，不整合到染色体中,不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。腺病毒包装简要流程1） 构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2) 采用 PacI 消化纯化的质粒.3) 消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。4) 将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒.5) 分装,-80保存。1.3、慢病毒和腺病毒的比较慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较病毒表达系统慢病毒表达系统(Len

12、tivirus）腺病毒表达系统（Adenovirus）病毒基因组RNA病毒双链DNA病毒复制自主复制自主复制是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞)及体内实验感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达高水平表达表达时间慢(13天）快（12天）滴度滴度最高可达10*8pfU/ml滴度最高可达1011pfU/ml克隆容量可插入不超过8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、构建

13、目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体,酶切，并测序鉴定2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定2。2质粒载体2。2。1概念能够进行自主复制的环状DNA双链结构,包括真核生物的细胞器(主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等.有些质粒称为附加体(

14、episome），这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制.通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中,通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒,以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。3。1大肠杆菌感受态细胞的制备1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37振荡培养过夜。2）取0。4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中,37振荡培养23h3

15、）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min4）4离心10min(4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min7）4离心10min（4000r/min）8）倒出上清液,用冰浴的0。1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞,200ul一份，4保存3。2质粒DNA的转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞,加入质粒DNA2ul混匀,冰浴30min2)离心管放到42保温90s3）冰浴2min4)每管加800ulLB液体培养基，37培养1h（150r/min）5)取适当体积(100ul）的复苏

16、细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min6）倒置平皿37，1216h，出现菌落3。3质粒提取步骤1）取14ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清2）加250ul溶液/RNaseA（溶液为细胞悬浮液)混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。3）加入250ul溶液（细胞裂解液)，轻柔的反复颠倒混匀56次。室温放置12min，使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。4）加入350ul溶液（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀.5）12000室温离心10min，收集上清。6)将上清置于DNA纯化柱中，静置12min。7）

17、12000转离心1min，弃滤液.8）加入500ul溶液PB(洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。10）12000转离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体.11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为8。08.5），室温放置2min。12)12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20保存.质粒提取步骤:吸取液体培养基于1。5ml离心管中12000转离心1min

18、,弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于20加250ulBufferS1悬浮细菌,悬浮均匀-加250ulBufferS2温和充分的上下翻转46次混合均匀，使菌体裂解加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min取上清液转移到专用的制备管（2ml）12000转离心1min，弃滤液加500ulBufferW112000转离心1min，弃滤液-加500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍-将制备管置回2ml离心管12000转离心1min-将制备管移入新的1.5ml离心管中，加6080ulEluent或离子水，室温1min

19、12000转离心1min移去制备管，将有质粒的离心管于4或是20保存4、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装)4.1名词解释293T细胞是由293细胞派生， 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体,可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。4.2共转染的操作步骤第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度第二天：1。 500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+1。5

20、ug psPAX2+1。5ug pMD2。G 2。 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体20003. 5min后,将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min 4。 从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。5。 6-10h后，移除含有DNA脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10FB（从此刻开始算时间）。第三天：1.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上第四天：1.转染后48和72h分别收获含病毒的上清。2.3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀.3.12000转离心浓缩细胞、分装80C贮存。

21、4。滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。4。3病毒包装的原理质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA）,但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒,其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒,通过 lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中,宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基

22、因再整合到靶细胞的基因组中,完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖,故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。5、慢病毒感染细胞5。1流程图5.2感染步骤1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜2）感染：将7080铺满12孔板中的培养液吸除,换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。3） 24h左右可换液,48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看.5。3荧光显微镜的操作流程打开荧光器(30

23、min内不能关闭，否则影响显微镜寿命),细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈,先用自然光观察视野内细胞，再关闭光,开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。（针对leica)5。4注意事项内容1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。2。感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度,在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基.3。在不明确细胞感染复数情况下,可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。4。在加病毒后一般24h左右可换液,48小时即可看荧光,具体时间根据细胞状态来看。6、感染后的细胞检测方法6.1荧光

24、初步检测若有荧光,则表示病毒感染成功,但并不能确定目的基因是否整合到细胞中,待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。6。2RNA的提取及RTPCR检测6.2。1原理因为真核细胞DNA含有很多非编码区,真核生物的DNA转录成为RNA之后,经过剪切和拼接,去掉这些非编码区，才能形成真正的mRNA,，是否表达真核生物的基因并表达相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RTPCR这条途径来测定RNA提取步骤加1mlTrizol，吹打后移至1.5ml无菌的离心管中;加100ul氯仿剧烈振荡30s混匀,12000转15min，可看到明显分层;取上层透明液体至新的1。5ml离心管中,加等体积的异丙醇，

25、混匀静置10min，12000转离心10min,弃上清，加1ml70乙醇,12000转，离心10min，弃上清,风干剩余液体，最后加DEPC水溶解RNA,电泳，粗步判定RNA纯度。6。2。3RT-PCR步骤：RT是一个逆转录的过程，用前一天提取好的总RNA，在加入引物，模版和酶,并在PCR仪的温度设置下，RNA可逆转录为cDNA.PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进行复制成双链DNA.(具体步骤省略）6.3蛋白提取及Western检测westernBloting：蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部

26、分组成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳,使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上, 用得最多的材料是硝酸纤维素膜（NC 膜）和 PVDF 膜, 蛋白转移的方法多用电泳转移 （转移电泳） ，它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶(AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X

27、光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中.学校报名号姓名 成绩四川省二一四年初中毕业生升学考试生物学科实验操作试题（八）观察叶片的下表皮（考试时间：10分钟）一、实验目的1制作叶片下表皮临时装片。2观察叶片下表皮的表皮细胞、保卫细胞、气孔的形态结构特点。二、实验材料用具新鲜菠菜，蚕豆或者其他叶片，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，滴管，吸水纸，清水、解剖针、纱布。三、实验操作要求1检查材料用具。2制作叶片下表皮临时装片。3用低倍镜观察临时装片。4实验结果：绘制叶片下表皮细胞、保卫细胞和气孔图并标注。5整理实验器材。学校 报名号 姓名 成绩四川省二一四年初中毕业生升

28、学考试生物学科实验操作试题（八）观察叶片的下表皮评分表实验步骤操作要求及评分标准分值得分1检查实验材料用具清点新鲜菠菜、蚕豆或者其他叶片，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，滴管，吸水纸，清水、解剖针、纱布。1分2制片A用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净，平放在实验台上，在载玻片中央滴一滴清水。（1分）B撕取一小块叶片下表皮，放在载玻片的水滴中并展平。（1分）C用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，然后慢慢放平，避免出现气泡。（1分）3分3观察A取镜对光。（1分）B安放玻片标本。（1分）C调焦看清物像。（1分）3分4实验结果绘制叶下表皮细胞、保卫细胞和气孔图并标注A用铅笔画图。（0.5分）B图像比例适当，在纸上位置要适中，一般稍偏左上方。（0.5分）C各结构的引线统一画到图旁右侧并标出各部分名称，图像名称书写在图的正下方。（0.5分） D图中比较暗的地方，用铅笔点上细点表示。（0.5分）2分5整理实验器材将显微镜复原。把用过的实验材料放到指定地点，其余材料用具摆放整齐，桌面保持整洁。（1分）1分合计10分监考教师：考生确认签名：