分子与细胞生物学基础课件.ppt

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1、植物生理与分子生物学 第一篇 分子与细胞生物学基础第3 章 植物蛋白质组学v 蛋白质组(proteome)被定义为protein complement expressed by a genome,即由一个基因组所表达的所有蛋白质。v 蛋白质组学(proteomics)表示对整个蛋白质组的研究，是指系统研究在某一特定时间、特定条件下，某一特定组织中的所有蛋白质。v 蛋白质组和基因组(genome)在概念上有相关性，代表某一个蛋白质组的蛋白质是由基因组所编码的，然而蛋白质组学和基因组学在研究对象和研究方法上有很大的区别，蛋白质组的复杂性远远高于基因组。v 蛋白质组学的目标是要回答关于蛋白质的四个方

2、面的问题：细胞中蛋白质的含量、定位、活性、修饰。植物蛋白质组的研究方法v 蛋白质双向电泳v 氨基酸序列测定v 质谱v 生物信息学蛋白质双向电泳v 蛋白质双向电泳(two-dimentional electrophoresis,2-DE)是研究蛋白质组的两个核心技术之一，也是研究蛋白质组动态变化的常用手段之一。蛋白质双向电泳根据蛋白质的等电点和相对分子质量的不同，分别通过第一维等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)和第二维SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)对蛋白质混合物进行分离。利用双向电泳研究植物蛋

3、白质组的基本流程：v 蛋白样品提取v 2-DE 分离蛋白v 蛋白质染色v 2-DE 图谱分析v 蛋白点切割v 蛋白酶解和鉴定双向电泳的缺陷和解决办法v 双向电泳在蛋白组的研究中存在一些缺陷，如分辨率低，尤其对低丰度的蛋白质和膜蛋白的检测；蛋白质定量比较困难；重复性以及耗时、自动化程度低等。v 这些缺陷可以通过一些手段来克服：(1)对样品进行前期分级；(2)对不同的细胞器或组织进行分离；(3)使用宽胶条，复合重叠窄IPG 凝胶；(4)荧光染料和双向荧光差异凝胶电泳；(5)多块胶垂直二维SDS-PAGE 系统；(6)2-DE 工作站质谱v 质谱(mass spectrometry,MS)技术是研究

4、蛋白质组的有一个核心技术，具有较高灵敏度，理论上可以鉴定含量在fmol 水平的蛋白质和多肽。v 质谱仪由离子源(ion sourse)、质量分析器(mass spectrometer)和离子检测器(ion detector)三部分组成。分离技术与质谱结合以及在植物蛋白质组研究中的应用v“鸟枪”法(shotgun method)v ICAT(isotope-coded affinity tagging,同位素编码亲和标签)和ITRAQv IMAC(immobilized metal affinity chromatography,固相化金属亲和色谱)v 硫醇亲和色谱(thiol affinity

5、 chromatography)和硫氧还蛋白亲和色谱(thioredoxin affinity chromatography)植物蛋白质组学的研究进展v 植物发育蛋白质组学的研究v 植物环境蛋白质组学的研究v 磷酸化蛋白质组学的研究(磷酸化蛋白的富集、以2-DE 为基础的磷酸化蛋白分析、鉴定磷酸化位点、植物磷酸化蛋白质组的研究现状)植物蛋白质组学研究的前景和挑战v 表达的整体分析以及蛋白质组编目v 大规模的蛋白质功能研究v 建立完整的蛋白质网络第4 章 叶绿体的分子生物学叶绿体的形态及增殖调控v 人们利用光学显微镜和电子显微技术对质体分裂的形态特征进行了详细的研究，发现质体分裂时的缢缩过程是由

6、一个称为质体分裂环(plastid divisionZ-ring,PD 环)的结构介导的。v 细菌细胞正常分裂时，在其中部形成介导细胞分裂的环状复合物结构，该环状复合物由10 多种蛋白质组成，其中，FtsZ(filamenting temprerature-sensitive)蛋白质最早在细胞中部装配成环状结构Z 环，其他蛋白质再先后与Z 环相结合行使其分裂功能。叶绿体分裂调控机制v FtsZ蛋白在原核细胞分裂中的作用v 原核细胞分裂位点的选择v 叶绿体分裂(1)质体分裂细胞学研究(2)ftsZ 基因在植物中的发现(3)植物FtsZ蛋白及其功能(4)叶绿体分裂装置(5)植物叶绿体分裂位点决定基

7、因AtMinD 与AtMinE叶绿体的生物化学v 叶绿体中进行的一些生物化学过程包括：(1)固定碳的贮藏(淀粉合成)和转运(2)亚硝酸盐还原(3)氨基酸合成(4)蛋白质合成(5)硫酸盐还原(6)DNA 和RNA 合成(7)脂质(糖脂、磷脂、硫脂)合成(8)四吡咯(叶绿素类、细胞色素类)合成(9)萜类(胡萝卜素类、叶醇、醌类侧链)合成(10)酚类合成(11)所有上述各类合成产物的降解叶绿体中新蛋白质形成的5 个特点v 叶绿体中的大部分多肽是由和基因编码并在细胞质中核糖体上合成的；v 细胞质中所合成的叶绿体多肽的前体几乎都带有一段转运肽(transit peptide)，这种前体被运入叶绿体时转运

8、肽被蛋白酶切去，同时相应的多肽则被运送到相应位点(targeting)；v 叶绿体基因组是必要的，它编码百种多肽和RNA;v 叶绿体编码的多肽与各种RNA 仅在叶绿体中起作用v 虽然叶绿体中大部分蛋白质在光下和暗中都可以被合成，转运和装配，但光对这些蛋白质在叶绿体中的积累却在不同水平上有促进作用叶绿体基因组叶绿体基因表达的调节v 叶绿体基因的启动子v 发育过程中叶绿体基因的表达及其光调节v 转录水平的调节v 翻译水平的调节转录水平的调节v 转录速率v RNA 的加工v mRNA 的稳定性转运肽叶绿体的遗传转化v 叶绿体遗传转化的原理v 叶绿体遗传转化的过程v 叶绿体遗传转化的方法v 选择筛选标

9、记基因v 叶绿体转化的特点v 叶绿体遗传转化的应用叶绿体遗传转化的原理v 将外源基因导入叶绿体需穿过单层细胞膜和叶绿体的双层膜，目的基因被送入叶绿体后，通过同源重组整合入叶绿体基因组。叶绿体遗传转化的过程v 转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体v 将外源表达框架整合到叶绿体的基因组中v 筛选具有转化的叶绿体细胞v 继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物叶绿体遗传转化的方法v 基因枪法v PEG 介导法v 激光微束转化法v 显微注射法v 农杆菌介导法叶绿体转化的特点v 目的基因转化效率高且后代表达稳定v 基因原核表达方式v 可同时进行多基因转化v 定点整合外源基因v 环境安全性

10、高叶绿体遗传转化的应用v 在植物抗性方面的应用(1)在抗除草剂抗性方面(2)在抗虫性方面(3)在抗逆性方面v 作物改良v 叶绿体遗传研究第5 章 细胞全能性和细胞工程v 植物细胞全能性（totipotency）：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。v 细胞工程(Cell engineering)：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。植物组织和细胞培养涉及细胞工程的技术包括下述

11、诸方面：v 试管苗快繁与脱毒v 花药和花粉培养v 体细胞无性系变异及分离突变体v 植物原生质体培养和细胞杂交v 人工种子v 植物细胞大量培养生产有用物质v 超低温种质保存试管苗快速繁殖的类型与方式大体有如下10 种：v 器官型(organ type)v 器官发生型(organogenesis type)v 胚状体发生型(embryonic type)v 原球茎型(procomb type)v 球茎芽型(globose stem bud type)v 块茎型(tuber type)v 鳞茎型(bulb type)v 孢子型(spore type)v 根茎型(rhizome type)v 无菌短枝

12、扦插型(minicutting type)试管苗快速繁殖中去除病毒的方法已发展出一系列成功的方法和检测手段，其中去除病毒的手段有以下几种：v 茎尖培养脱毒v 物理学方法脱毒v 化学疗法脱毒v 花药培养是指利用植物组织培养技术，把花粉发育到一定阶段的花药，接种到人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体直接发育为植株或使愈伤组织分化成植株。v 花粉培养是从花药游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植株的一种技术。它不但可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，还可以从较少的花药获得大量的花粉植株。花药培养方法：v 花药培养产生花粉植株

13、一般有两种途径：其一是花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株，例如烟草、曼陀罗等；其二是华耀中的花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再诱导其分化植株，例如禾谷类的水稻、玉米等。v 花药培养时诱导花粉植株能否成功及诱导频率如何均受多种因素的影响，其中主要有供试材料、培养基组成及培养方法和条件等。供试材料在接种前对所用的材料要进行严格的选择：(1)材料的基因型(2)生理状况(3)花粉发育时期(4)材料的预处理(5)材料的接种培养基v 基本培养基的组成对花药培养成功率有显著影响v 培养基中的蔗糖在相当长时间里被认为不仅是最好的碳源，而且还起着调节渗透压的作用。v 激素对于绝大多数植物的离体花粉的发育常

14、常起着关键的作用。v 某些有机附加物如水解乳蛋白或水解酪蛋白，酵母提取物、肌醇、谷氨酰胺等都能促进花粉愈伤组织的生长。v Anognostakis(1974)将1%的活性炭加入烟草花药的培养基中，从而使花粉植株的产量提高了12 倍。v 中科院遗传研究所(1976)提出了一种以马铃薯提取物为主要成分的马铃薯培养基用它培养小麦花粉，花粉愈伤组织的诱导率比在MS培养基上提高45 倍。培养方法和培养条件v 琼脂固化培养基和液体培养基v 温度和光照条件植株的诱导和移栽花粉植株的倍性和加倍花粉培养v 花粉的分离v 花粉培养方法v 花粉作为外源基因受体花粉的分离v 挤压法v 磁拌法和漂浮释放法v 超速旋切法花粉培养方法v 直接培养v 花药经预培养后分离的花粉培养v 在培养基中添加花药提取物的花粉培养体细胞无性系变异及分离突变体v 体细胞无性系变异与诱导突变体所产生的特征在如下三个方面具有相似性：(1)随机性和变异谱甚广，而且无法准确地分批重复(2)变异频率多样性(3)可导致整个种群的改变，即某个形状的均值的改变，而不是该性状方差的增加v 对突变体的利用主要包括三个方面：(1)作为遗传学研究的好材料(2)是发育与代谢研究的有用材料(3)利用有益性状的突变育种植物细胞大量培养生产有用物质v 愈伤组织的诱导和继代培养v 细胞悬浮培养v 愈伤组织的再形成v 植株再生