基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制.ppt

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1、重组基因工程药物的分离重组基因工程药物的分离纯化及质量控制纯化及质量控制基因工程药物制造的一般流程：基因工程药物制造的一般流程：（1 1）获得目的基因；）获得目的基因；（2 2）组建重组质粒；组建重组质粒；（3 3）构建基因工程菌；）构建基因工程菌；（4 4）培养工程菌；）培养工程菌；（5 5）产物分离纯化；）产物分离纯化；（6 6）除菌过滤；）除菌过滤；（7 7）半成品检定；）半成品检定；（8 8）包装）包装 基因工程药物特点基因工程药物特点:(1)(1)目的产物目的产物在初始原料中的在初始原料中的含量较低含量较低;(2)(2)含目的产物的初始物料含目的产物的初始物料组成复杂组成复杂,除了目

2、的产物外除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特 别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；(3)(3)目的产物的目的产物的稳定性差稳定性差，具有生物活性的物质对，具有生物活性的物质对 pH pH、温度、金属离子、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表有机溶剂、剪切力、表 面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；(4)(4)种类繁多种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或，包括大、中、小分子、结构简单或(5)(5)复杂的有机化合物，以及结构复杂又性

3、质各异复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异(6)(6)的生物活性物质；的生物活性物质；(5)(5)应用面广应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求，对其质量、纯度要求高，甚至要求(6)(6)无菌、无热源。无菌、无热源。目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。化性质和生物学特性来决定。化性质和生物学特性来决

4、定。化性质和生物学特性来决定。产产产产 物物物物 特特特特 性性性性 作作作作 用用用用 等电点等电点等电点等电点 决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件相对分子量相对分子量相对分子量相对分子量 选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质疏水性疏水性疏水性疏水性 与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度生物特异性生物特异性生物特异性生物特异性 决定亲和配基决定亲和配基决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性溶解性溶解性 决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及

5、蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性稳定性稳定性 决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流程时间建立分离纯化工艺的根据建立分离纯化工艺的根据建立分离纯化工艺的根据建立分离纯化工艺的根据 1 1、含目的产物的起始物料的特点、含目的产物的起始物料的特点 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。（1 1）菌种类型及其代谢特性菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，包括菌种的

6、生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；毒素和能降解产物的酶类等；（2 2）原材料和培养基的来源及其质量原材料和培养基的来源及其质量；（3 3）生产工艺和条件：生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式包括灭菌方式和条件，生产方式 （连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工 艺控制条件因素几方式等；艺控制条件因素几方式等；（4 4）初始物料的物理、化学

7、和生物学特性初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓包括产物浓 度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解 度、度、pHpH、黏度、流体力学性质和热力学性质。、黏度、流体力学性质和热力学性质。2 2、物料中杂质的种类和性质、物料中杂质的种类和性质 物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。挥发性、吸附性能等。3 3、目的产物特性、目的产物特性 产物的化学、物理和生物学特性，

8、包括化学组成、产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。4 4、产品质量的要求、产品质量的要求 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用

9、的影响，产杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。品剂型、贮存稳定性等。特别注意特别注意3 3类可能存在的非蛋白质类杂质：类可能存在的非蛋白质类杂质：（1 1）DNADNA的去除：的去除：在利用离子交换时，控制样液的在利用离子交换时，控制样液的pHpH值，使值，使DNADNA不被吸附，而蛋白质可以被吸附；或利用亲不被吸附，而蛋白质可以被吸附；或利用亲和层析；和层析；（2 2）病毒的去除：）病毒的去除：成品中必须检查是否含有病毒。成品中必须检查是否含有病毒。病毒最大的来源是由宿主细胞带入。经过色谱分离，病毒最大的来源是由宿主细胞带入。经过色谱分离，一般能将病毒除去，

10、必要时也可以用紫外线照射使一般能将病毒除去，必要时也可以用紫外线照射使病毒失活，或用过滤法将病毒去除。病毒失活，或用过滤法将病毒去除。（2 2）热原的去除：）热原的去除：热原主要是肠科杆菌科所产生的热原主要是肠科杆菌科所产生的细胞内毒素细胞内毒素，在细菌生长或细胞溶解时会释放出来，在细菌生长或细胞溶解时会释放出来，主要是细胞壁成份主要是细胞壁成份脂多糖脂多糖，其性质相当稳定，即使，其性质相当稳定，即使经高压灭菌也不失活。注射用药必须无热原。经高压灭菌也不失活。注射用药必须无热原。从蛋白质溶液中除去内毒素比较困难，最好的办法是从蛋白质溶液中除去内毒素比较困难，最好的办法是防止产生热原，整个生产过

11、程要在无菌条件下进行，防止产生热原，整个生产过程要在无菌条件下进行，所有层析介质在使用前都要先除去热原，在所有层析介质在使用前都要先除去热原，在2828下下进行操作。洗脱液需先经过无菌处理，流出的蛋白质进行操作。洗脱液需先经过无菌处理，流出的蛋白质溶液也应无菌处理，即经过溶液也应无菌处理，即经过0.2m0.2m滤膜过滤。滤膜过滤。脂多糖带负电，可以用阴离子交换层析法去除；是疏脂多糖带负电，可以用阴离子交换层析法去除；是疏水的，也可以用疏水层析法。水的，也可以用疏水层析法。基因工程药物分离纯化的一般流程基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液发酵液发酵液发酵液细胞分离细胞分离细胞分离细胞分离胞内产胞

12、内产物物胞外产胞外产物物细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离固液分离固液分离包涵体包涵体包涵体包涵体细胞碎片分离细胞碎片分离细胞碎片分离细胞碎片分离变变变变 性性性性复复复复 性性性性浓浓 缩缩初步分离初步分离初步分离初步分离高度纯化高度纯化高度纯化高度纯化制制制制 剂剂剂剂产产产产 品品品品A A 重组重组基因工程药物基因工程药物分离纯化方法选择分离纯化方法选择的基因原则的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组

13、蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、

14、采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在浓度低，因此应在浓度低，因此应在浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方纯化之前采用沉淀或超滤等方纯化之前采用沉淀或超滤等方纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；组蛋白，应先离心回收包涵体；组蛋白，应先离心回收包涵体；组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，拟首先选采用融合型战略表达重组蛋白，拟首先选采用融合

15、型战略表达重组蛋白，拟首先选采用融合型战略表达重组蛋白，拟首先选用用用用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选

16、择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（等电点处于极端区域（等电点处于极端区域（等电点处于极端区域（pIpI5 5 5 5 或或或或 pIpI8888）的重组）的重组）的重组）的重组蛋白应首选离子蛋白应首选离子蛋白应首选离子蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去交换法进行分离，这样很容易除去交换法进行分离，这样很容易除去交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；几乎所有的杂蛋白；几乎所有的杂蛋白；几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都重组蛋白

17、特异性的配体、底物、抗体、糖链等都重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是是是是亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应合适的范围内（蛋白之间的解离常数应合适的范围内（蛋白之间的解离常数应合适的范围内（蛋白之间的解离常数应合适的范围内（1010-8-8-10-10-4-4 mol/Lmol/L）；）；）；）；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一径向层析是近年来发展起来的集层析分

18、离和膜分离于一径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。极大的优越性。极大的优越性。极大的优越性。疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积进行分离的；凝胶过滤层析是

19、根据蛋白的分子量和体积进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；差异进行分离的；差异进行分离的；差异进行分离的；多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来多种技术，一般来多种技术，一般来多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵说，在选择分离纯化方法时应遵说，在选择分离纯化方法时应遵说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：循下列原则：

20、循下列原则：循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应首先选择能除去含量最多杂质的方法应首先选择能除去含量最多杂质的方法应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应尽量选择高效的分离方法应尽量选择高效的分离方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安应将最费时、成本最高的分离纯化方法安应将最费时、成本最高的分离纯化方法安应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段排在最后阶段排在最后阶段排在最后阶段合适分离

21、纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有常用的蛋白质分离纯化介质有常用的蛋白质分离纯化介质有常用的蛋白质分离纯化介质有SephadexSephadex和和和和SepharoseSepharose。理想的分。理想的分。理想的分。理想的分离纯化介质应具有下列性质：离纯化介质应具有下列性质：离纯化介质应具有下列性质：离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性对目标蛋白不会造成变性对目标蛋白不会造成变性对目标蛋白不会造

22、成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好化学性能和机械性能稳定，重复性好化学性能和机械性能稳定，重复性好化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉价格低廉价格低廉价格低廉分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程大规模产业化过程大规模产业化过程大规模产业化过程未必合适，如：未必合适，如：未必合适，如：未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞实验室方法在工程上可能难以实

23、现（超声波破细胞实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）壁）壁）壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高实验室方法在大规模生产中可能成本过高实验室方法在大规模生产中可能成本过高实验室方法在大规模生产中可能成本过高(超速离心）超速离心）超速离心）超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。产工艺。产工艺。产工艺。比较指标比较指标 表表 达达 系系 统统大肠杆菌大肠杆菌酵酵 母母 菌菌哺乳动物细胞哺

24、乳动物细胞昆虫细胞昆虫细胞1外源基因表外源基因表达水平达水平高高比较高比较高不高不高不高不高(家蚕除外家蚕除外)2培养条件培养条件易易易易难难较难较难3表达产物的表达产物的形式形式多数不能分泌，多数不能分泌，胞内形成包涵体胞内形成包涵体多数能分泌，多数能分泌，少数在胞内形少数在胞内形成包涵体，有成包涵体，有时产物不均一时产物不均一一般都能分泌一般都能分泌一般都能分泌一般都能分泌4表达产物的表达产物的糖基化糖基化不能糖基化不能糖基化能糖基化，但能糖基化，但糖基化程度与糖基化程度与天然产物有差天然产物有差别别糖基化好，近糖基化好，近似天然产物似天然产物能糖基化，但糖能糖基化，但糖基化程度与天然基化

25、程度与天然产物有差别产物有差别5产物纯化工产物纯化工艺艺细胞破壁容易，细胞破壁容易，多数产物需多数产物需“复复性性”，工艺较复，工艺较复杂杂胞内表达破壁胞内表达破壁困难；分泌物困难；分泌物纯化工艺简单纯化工艺简单纯化简单纯化简单纯化较简单纯化较简单(家蚕家蚕除外除外)6生产成本生产成本高，主要化费在高，主要化费在纯化方面纯化方面低低高，主要花费高，主要花费在培养条件方在培养条件方面面高，主要花费在高，主要花费在培养条件方面培养条件方面(家家蚕除外蚕除外)7稳定性稳定性差差较好较好好好较好较好8难点难点复性复性破壁破壁培养培养培养培养 分离纯化技术要求：分离纯化技术要求：（1 1）技术条件要温和

26、，能保持目的产物的生物活性；）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；（2 2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；（3 3）收率要高；）收率要高；（4 4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；以处理或调整，这样可减少工艺步骤；（5 5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。要求。一是破碎抽提一是破碎抽提，即把蛋白从材料转入溶剂中制成蛋白质，即把蛋

27、白从材料转入溶剂中制成蛋白质溶液；溶液；二是纯化二是纯化，即把杂质从蛋白质溶液中除掉或从蛋白质溶，即把杂质从蛋白质溶液中除掉或从蛋白质溶液中把蛋白质分离出来；液中把蛋白质分离出来；三是制剂三是制剂，即将蛋白质制成各种剂型。，即将蛋白质制成各种剂型。根据蛋白本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列根据蛋白本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题问题:(1)(1)要注意防止蛋白的变性失活要注意防止蛋白的变性失活.(2)(2)蛋白的分离纯化的目的是将目标蛋白以外的所有杂质蛋白的分离纯化的目的是将目标蛋白以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需蛋白的条件下，可尽可能的除去，因此，在不破坏所需

28、蛋白的条件下，可使用各种使用各种“激烈激烈”的手段。的手段。重组重组蛋白的分离提纯包括三个基本环节：蛋白的分离提纯包括三个基本环节：蛋白蛋白的的纯化化过程，程，约可分可分为三三个阶段个阶段：(1)(1)粗粗蛋白质蛋白质(crude (crude protein):protein):采样采样 均均质质打破打破细胞胞 抽出全蛋白抽出全蛋白.(2)(2)部分部分纯化化(partially (partially purified):purified):初步的初步的纯化，化，使用各使用各钟 柱柱层层析法析法。(3)(3)均均质蛋白质蛋白 (homogeneous):(homogeneous):目标蛋白目

29、标蛋白的的进进一步精制一步精制纯化，可用化，可用制备制备式式电泳电泳 或或 HPLCHPLC。蛋白分离纯化不同阶段蛋白分离纯化不同阶段细胞结构与蛋白分布细胞结构与蛋白分布细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细菌：细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。于肽聚糖的网状结构。酵母菌：酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。真菌：真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，多糖，蛋白质，脂类，葡

30、聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。1 细胞破碎细胞破碎许多蛋白存在于细许多蛋白存在于细胞内。为了提取这胞内。为了提取这些胞内些胞内蛋白蛋白，首先，首先需要对细胞进行破需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机细胞胞破破碎碎珠珠高高压细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀玻璃匀浆机机机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎

31、法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的通过机械运动产生的剪切力，使组织、细剪切力，使组织、细胞破碎。胞破碎。通过各种物理因素的通过各种物理因素的作用，使组织、细胞作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而的外层结构破坏，而使细胞破碎。使细胞破碎。通过各种化学试剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，对细胞膜的作用，而使细胞破碎而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受

32、到破使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎坏，而达到细胞破碎细细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理细胞破碎机理图细胞破碎机理图常用常用细胞破碎技术和细胞破碎技术和设备设备u机械法：机械法：研磨，匀浆器，组织捣碎法，压榨器研磨，匀浆器，组织捣碎法，压榨器u物理处理法：物理处理法：超声波超声波u化学法：化学法：u酶解法：酶解法：机械法机械法 机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的.包括珠磨法包括珠磨法,高压匀浆法和超声破碎法高压匀浆法和超声破碎法WSK卧式高效全能珠磨机卧式高效全能珠磨机

33、高速珠磨机高速珠磨机(high(high spced bead mill)spced bead mill)研磨是常用的一种方研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞起快速搅拌，使细胞获得破碎。获得破碎。在工业规模的破碎中在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机常采用高速珠磨机砂磨机砂磨机高速珠磨机高速珠磨机高压匀浆器高压匀浆器影响匀浆破碎的主要影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。通过匀浆器阀的次数。高压匀浆法的适用范高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细围较广，

34、在微生物细胞和植物细胞的大规胞和植物细胞的大规模处理中常采用模处理中常采用.高压匀浆器高压匀浆器高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围：高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）浆阀）撞击破碎

35、器撞击破碎器超声波破碎器超声波破碎器超声波处理细胞悬浮液时，超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、外介质的离子强度、pHpH值、值、菌体的种类和浓度也有很大菌体的种类和浓度也有很大的影响的影响.超声波振荡过程中遇到的最超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实规模工业上的应用，但在实验室和小规

36、模生产中是一种验室和小规模生产中是一种很好的方法很好的方法JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机酶解法酶解法 是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以在细胞悬浮液中加而达到破碎目的。酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。入特定的酶，也可以采用自溶作用。酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，

37、故小规模应用较广规模应用较广.1 1）外加酶法）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1-1，3-3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1-1，6-6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等外加酶法外加酶法酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。据细胞的结构和化学组成来选择。l溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于细

38、菌类细胞壁的裂解。革兰糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂剂EDTAEDTA一起使用。一起使用。l放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖

39、酶等。丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。l植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。维素酶裂解。外加酶法外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞

40、膜破质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。裂，释出胞内产物。酶解法的特点酶解法的特点 优点：优点：u发生酶解的条件温和发生酶解的条件温和u能选择性地释放产物能选择性地释放产物u胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：缺点：溶酶价格高，溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在。产物抑制的存在。酶解酶解-自溶作用自溶作用 l 自溶作用是酶解的另一种方法，自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。l

41、在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。它的自溶酶，以达到自溶目的。l缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。悬浮液粘度增大，过滤速度下降。渗透压冲击法冻融法化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。

42、常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。有选择地渗透出来。化学渗透法（化学渗透法（Chemical permeationChemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用采

43、用6mol/L HCl6mol/L HCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。成本低，反应激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法）酸、碱处理法细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；。，阴离子型）；。非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，

44、使某些胞内物质释脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。放出来。（2 2）表面活性剂）表面活性剂无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解透性增加或溶解2 2 浓缩浓缩 提取液或发酵液的蛋白浓度一提取液或发酵液的蛋白浓度一 般很低，般很低，如发酵液中蛋白浓度一般为如发酵液中蛋白浓度一般为0.10.1一一1 1.因此，因此，在分离纯化过程中，蛋白溶液往往需要浓缩。

45、在分离纯化过程中，蛋白溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如：盐析或溶剂沉淀法、超浓缩的方法很多，如：盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等。这些方法既是浓过滤法、离子交换树脂法等。这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段缩的方法，又是分离纯化的手段(我们将在下我们将在下节中介绍节中介绍)再如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、再如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。2.12.1冷冻干燥法冷冻干燥法 将蛋白溶液冻成固体后抽真空，将蛋白溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最后蛋白呈干粉状。采使水分子直接从表面升华，最后蛋白呈干粉状。

46、采用这种方法能使多种蛋白活性长期保存。但操作需用这种方法能使多种蛋白活性长期保存。但操作需注意几个问题：注意几个问题：:首先被冻的最好是蛋白的水溶液。如果混有有机首先被冻的最好是蛋白的水溶液。如果混有有机溶剂，会降低水的冰点，在干燥时样品融化而起溶剂，会降低水的冰点，在干燥时样品融化而起泡导致蛋白变性，同时，会使真空泵失效。泡导致蛋白变性，同时，会使真空泵失效。:其次，如果混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引起其次，如果混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引起pHpH的变化，例如的变化，例如,pH 7,pH 7的磷酸盐在冷冻时由于磷酸二的磷酸盐在冷冻时由于磷酸二氢钠会结晶析出，在溶液完全冷冻以前，氢钠会结晶析出

47、，在溶液完全冷冻以前，pHpH便变成便变成3.53.5左右。因此，在冷冻前，需将蛋白溶液脱盐。左右。因此，在冷冻前，需将蛋白溶液脱盐。2.22.2蒸发法蒸发法 通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩的蛋白溶液在高度真空下转变成极法，即将待浓缩的蛋白溶液在高度真空下转变成极薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分

48、离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜分离器，将蒸汽分离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多种。根据物料不同而加以选择。种。根据物料不同而加以选择。2.32.3超滤超滤 超滤是在加压的条件下，将蛋白溶液通过一层只超滤是在加压的条件下，将蛋白溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜而目的蛋白允许小分子物质选择透过微孔半透膜而目的蛋白等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。如果等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。如果采用不同孔径的膜，同时又具有分级分离的作用采用不同孔径的膜，同时又具有分级分离的作用.这这种方法具有下列优

49、点：不需加热，更适用于热敏物种方法具有下列优点：不需加热，更适用于热敏物浓缩；无相变化、设备简单、操作方便；能在广泛浓缩；无相变化、设备简单、操作方便；能在广泛的的pHpH条件下操作等，因此，近年来发展很快。条件下操作等，因此，近年来发展很快。借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及以及尼龙尼龙等高分子等高分子聚合物制成的

50、高分子膜。有时也可以采用动物膜等。聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。膜分离加压膜分离加压膜分离 微滤微滤超滤超滤反渗透反渗透电场膜分离电场膜分离 电渗析电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 扩散膜分离扩散膜分离 透析透析膜分离技术膜分离技术过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留