微生物学设计性实验细菌耐受噬菌体突变率测定.ppt

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1、1细菌耐受噬菌体突变率的测定细菌耐受噬菌体突变率的测定 微生物创新性试验微生物创新性试验微生物创新性试验微生物创新性试验第五组：第五组：第五组：第五组：2 细菌耐受噬菌体的突变是一种自发突细菌耐受噬菌体的突变是一种自发突变，它的发生与环境因子无关，是随机的变，它的发生与环境因子无关，是随机的非定向突变。非定向突变。本组设计性实验题目：测定铜绿假单胞菌耐受噬菌体的突变频率测定铜绿假单胞菌耐受噬菌体的突变频率3实验选材依据和背景实验选材依据和背景铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠

2、道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。4革兰染色革兰染色培养培养绿脓杆菌绿脓杆菌研究背景研究背景本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，及术后或某些治疗后的患者易感本菌。筛选出优良菌种，以便更好地利用其资源进行研究并造福人类。同时又对其外界环境有更大的适应性，更好应用于发展、生产的需要。为获得其菌群，我们采用利用噬菌体将其敏感细菌杀死，从而选择耐受细菌。56研究研究概述概述研究方案：研究方案：为获得其菌群，我们采用噬菌体将敏为获得其菌群，我们采用噬菌体将敏感细菌杀死，将发生了耐受突变的细菌选择出来，感细菌杀死，将发生了耐受突变的细菌选择

3、出来，并繁殖成为优势菌群。并繁殖成为优势菌群。研究意义：研究意义：培养出优势菌群，为以后临床治疗培养出优势菌群，为以后临床治疗及临床用药起辅助性作用。及临床用药起辅助性作用。研究目的：研究目的：测定细菌自然情况下耐受噬菌体的测定细菌自然情况下耐受噬菌体的自发突变频率。自发突变频率。研究问题：研究问题：突变率测定突变率测定实验材料实验材料1.毒性噬菌体及其相应的敏感宿主菌。毒性噬菌体及其相应的敏感宿主菌。（建议使用人体正常菌群中的细菌及其噬菌体，如大肠埃希菌或铜绿假单胞菌及其相应噬菌体。）2.LB液体培养基及液体培养基及LB固体培养基。固体培养基。3.试管、培养皿、刻度定量吸管。试管、培养皿、刻

4、度定量吸管。4.酒精灯、接种环、显微镜、普通培养箱等酒精灯、接种环、显微镜、普通培养箱等。7LB是什么？LB：Luria-Bertani培养基，即溶菌肉汤。8实验步骤实验步骤91.准备好铜绿假单胞菌的过夜培养物和相应的噬菌体原液（噬菌体效价1010）铜绿假单胞菌的铜绿假单胞菌的倒置倒置过夜过夜培养物培养物噬噬菌菌体体原原液液实验步骤2.将菌液10倍连续稀释，至少稀释7管，取0.1ml涂布接种LB琼脂平板，37度培养过夜。次日取菌落适宜于菌落计数的平板进行CFU计数，计算出每毫升菌液中的CHU数：CFU数数=每个平皿中的每个平皿中的CFU数数10血清稀释倍数血清稀释倍数102.1110倍连续稀释

5、，至少倍连续稀释，至少7管管CFU是什么？是什么？CFU(Colony-Forming Units)：菌落形成单位,菌落形成单位。将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数量进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌落）的细菌数量进行测量的单位。单位：CFU/mL。指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数，也有用CFU/g即对应固体培养基。12通俗的解释 是指每毫升菌液中含有多少单细胞。传统上就叫“个”。但是，我们知道，一个菌落不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成

6、，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。13实验步骤实验步骤3.进入对数生长后期的大肠埃希菌或铜绿假单胞菌，菌数约为109CFU/ml左右。23h后，可见菌液逐步变清，待完全变清（月4h之内），将全部菌液均匀涂布到一个LB琼脂平板上，置37下培养过夜。次日计数CFU。144.耐受噬菌体突变频率的计算 第3步中获得的CFU数为1ml菌液中的耐受菌数量，第2步中获得的CFU数为1ml菌液中的总菌数。故：耐受噬菌体突变频率耐受噬菌体突变频率 =15第第3步中获得的步中获得的CFU数数第第2步中获得的步中

7、获得的CFU数数实验可行性分析实验可行性分析1.标本采集方便标本采集方便 本菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。采自不同感染部位的标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。162.分离培养容易本菌生长对营养要求不高。3.生长特点明显该菌在4不生长而在42可以生长。（可用以鉴别）4.采用CFU计数的科学性。5.实验现象明显，便于观察。17预期结果预期结果18稀释度稀释度10-110-110-210-210-710-71 1 2 2

8、3 3平平均均1 12 2 3 3平平均均1 1 2 2 3 3平平均均CFUCFU数数/平板平板 每毫升每毫升的的CFUCFU数数预期结果经相关文献预测：铜绿假单胞菌耐噬菌体的突变机率在1.410-77.910-7之间。19讨论讨论上述操作3，通常在4h内菌液会完全变清。此时细菌尚处于生长曲线的“迟缓期”（即适应期），亦即尚未进入分裂状态。如果少数事先存在的耐受菌已进入分裂期，这是测定结果会被放大，因而失其准确性。20思考题(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45左右才能倒平板？(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。21参考文献 微生物学通报 MICROBIOLOGY 国际标准刊号：ISSN 0253-2654 国内统一刊号：CN 11-1996/Q 铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定 张克斌张克斌 陈志瑾陈志瑾 等等 第三军医大学基础部微生物学教研室第三军医大学基础部微生物学教研室2223