【高中生物】重组DNA技术的基本工具课件 2022-2023学年高二生物人教版选择性必修3.pptx

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1、20172017年版年版20202020年修订生物课程标准：年修订生物课程标准：1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具旧教材：限制性核酸内切酶新教材：限制性内切核酸酶统称：限制酶教师解读注意第3章 基因工程指按照 ,进行严格的设计并通过 DNA重组和 等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的 。由于基因工程是在 上进行设计和施工的，因此又叫作 。人们的愿望体外转基因新的生物类型和生物产品DNA分子水平DNA重组技术操作水平：原理：DNA 分子水平基因重组优点：克服远缘杂交不亲和障碍、改造生物性状定向操作环境：操作对象：生物体外基因第1

2、节 重组 DNA 技术的基本工具第3章 基因工程非转基因番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭转基因番木瓜利用“分子工具”可以抵御番木瓜环斑病毒本节聚焦：重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它 们的作用分别是什么？精准切割DNA分子“分子手术刀”将DNA片段再连接起来“分子缝合针”将体外重组好的DNA分子导入受体细胞“分子运输车”一.“分子手术刀”限制性内切核酸酶（简称：限制酶）1.来源：主要从 中分离纯化出来的。原核生物2.种类：数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）3.作用：能识别双链DNA分子的 序列，并使每一条链中特定部位的 断开。特定核苷酸磷酸二酯键4.特点：专一性大多数限制酶的识别序

3、列由 组成，也有少数为4个或8个或其他数量。6个核苷酸 分子手术刀 分子缝合针 分子运输车一.“分子手术刀”限制性内切核酸酶（简称：限制酶）5.结果：产生DNA片段末端（通常有 和 两种形式）黏性末端平末端EcoR ISma I55335533黏性末端平末端中轴线从53方向的识别序列均为GAATTC，并切断G和A之间的磷酸二酯键从53方向的识别序列均为CCCGGG，并切断C和G之间的磷酸二酯键5533且在中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。分子手术刀 分子缝合针 分子运输车 【推测】观察如下限制酶所识别的序列有什么特点？在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条链反向读的

4、碱基序列完全一致。下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）AGAATTC CTTAAG BGGGGCCCC CCCCGGGG CCTGCAG GACGTC DCTAAATC GATTTAG D反馈练习【考题链接】限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？会不会切割自身DNA?原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，但是不会切割自身的DNA，以保证自身的安全。二.“分子缝合针”DNA连接酶1.作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶

5、切开的两个核苷酸之间的 。磷酸二酯键 分子手术刀 分子缝合针 分子运输车【思考】连接的黏性末端需要满足什么条件？遵循碱基互补配对原则DNA连接酶没有识别序列的特异性2.种类：类型Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶来源_功能只缝合_缝合_和_结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端（效率低）磷酸二酯键 T A A A T C-G-C -G A T T T A DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形

6、成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键【总结】几种相关酶的比较名称作用部位作用结果限制酶 DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对之间的氢键将DNA切成两个片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链反馈练习根据所学知识，完成以下填空：限制酶 解旋酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶ba磷酸二酯键氢键A.切断a处的酶为_B.连接a处的酶为_C.切断b处的酶为_

7、 三.“分子运输车”基因进入细胞的载体1.作用：将外源基因送入受体细胞,在受体细胞内对目的基因进行大量复制。2.种类：质粒动植物病毒噬菌体（最常用）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有 能力的 。自我复制环状双链DNA分子它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大的差别。分子手术刀 分子缝合针 分子运输车三.“分子运输车”基因进入细胞的载体3.运载体需具备的条件：有一个至多个限制酶切点便于插入（携带）目的基因有某些标记基因（便于鉴定和筛选筛含有重组DNA分子的细胞）对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动（以

8、质粒为例）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存（自我复制或者插入到受体DNA同步复制）真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。分子手术刀 分子缝合针 分子运输车环状DNA【拓展】标记基因对重组DNA的鉴定和选择原理重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低如:绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)标记基因通常有:抗生素的抗性基因如:抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)荧光蛋白基因存活不存活重组DNA分子用EcoRI限制酶切割下列两段DNA序列:5-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-33-TATCGTACGAT

9、AGGTACTTAAGCCGTATG-55-TCCTAGAATT CTCGGTATGAATTCCATAC-33-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-55533【思考与讨论】5-ATAGCATGCTATCCATG3-TATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC-3 GCCGTATG-5AATT CTCGGTATG GAGCCATACTTAA【思考】要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？5-TCCTAGAATTC.GAATTCCATAC-33-AGGATCTTAAG.CTTAAGGTATG-5AATT C.G

10、 G.CTTAA要切 切口，产生 黏性(平)末端。2个4个5-TCCTAG3-AGGATCTTAAAATTCCATAC-3GGTATG-5粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端目的基因1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？【讨论】剪刀代表限制酶，透明胶条代表DNA连接酶。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互相配对？如果不能，可能是什么原因造成的？可能是剪切位点或连接位点的选择不对（也可能是其他原因）。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一般要求有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端，否则黏性末端不同，碱基就无法配对。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能。真正

11、的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。【探究与实践】DNA的粗提取与鉴定材料用具1.选材：DNA含量 的生物组织，相对较高如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中 没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）2.试剂：研磨液破坏细胞，释放出细胞内的物质体积分数为95%的酒精 析出DNA2mol/L 的NaCl溶液溶解DNA二苯胺试剂鉴定DNA（要现配现用）蒸馏水（洗涤剂和食盐）方法步骤1.破碎细胞称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，研磨。洋葱研磨液充分【思考】如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？研磨不充分，会使

12、DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。2.去除杂质在漏斗中垫上 过滤研磨液，4冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。纱布上清液上清液【思考】过滤能否用滤纸代替纱布？不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。方法步骤3.DNA的粗提取【思考】此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。在上清液中加入体积相等的 溶液,静置23min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA。预冷的酒精白色丝状物【思考】此步骤的目的是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出

13、。【拓展】预冷的酒精的优点可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。析出DNA方法步骤析出DNA3.DNA的粗提取用玻璃棒沿 搅拌，卷起 ，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取 晾干。一个方向沉淀物【思考】为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？避免破坏DNA4.DNA的鉴定取 20mL的试管，各加入 的NaCl的溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中加入4mL的 试剂。混合均匀后，将试管置于 中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中颜色的变化。实

14、验组对照组2mol/L二苯胺沸水丝状物两支结果分析与评价1.如果提取出来的不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。2.DNA与二苯胺试剂呈 ，颜色的深浅与 有关。蓝色DNA的含量考点注意1.如果使用离心方法，共有2次离心：第1次取上清液，第2次取沉淀物。2.如果低温静置后取上清液，后加入遇冷酒精再静置，溶液出现白色丝状物即粗提DNA。DNA+二苯胺蓝色沸水加热练习与应用一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述 正确的是（）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA

15、片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的 平末端C练习与应用一、概念检测2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（）A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针A二、拓展应用2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的 DNA片段相连接?为什么?Xba因为Xba与Spe切割产生了相同的黏性末端