(4.2)--第一章酶工程概述酶工程教学.ppt

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1、生物技术的四大支柱蛋白质工程抗体工程糖链工程海洋生物技术生物转化核心和关键基础条件获得产物的手段课程关系o前修课程：有机化学、生物化学、微生物学、分子生物学等o交叉课程：细胞工程、基因工程、发酵工程等第一章 酶工程概述o酶的基本概念与发展历史o酶的催化作用o酶工程发展概况一、酶1.定义：具有生物催化功能的生物大分子o对生物体作用：调节一切代谢反应o意义：阐明生命现象的本质，掌握生命活动的规律，进而改造生命第一节 酶的基本概念与发展历史研究热点！Nature,2015Science,2016Nature,2017一、酶2.分类：o蛋白类酶（proteozyme）o核酸类酶（ribozyme）蛋白

2、类酶的分类核酸类酶的分类p人们对酶的认识起源于生产与生活实践。p夏禹时代：掌握了酿酒技术。p周朝：制作饴糖和酱。p春秋战国时期：用麴（曲）治疗消化不良p1716年：酶者，酒母也 不自觉的应用二、酶学研究简史u 法国著名科学家雷默（1683-1757）认为消化是在胃液作用下的化学过程而不仅仅是个物理过程。u 1777年，意大利物理学家斯帕拉捷的山鹰实验证明，在胃液中存在一些特殊的活性成分。u 1822年，美国外科医生博蒙特研究食物在胃里的消化。u 19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。胃肠消化胃本身也是由蛋白质组成的，那么酶为什么没有将胃消化掉呢？胃本身也是由蛋白质组成的，酶为什么没有将

3、胃消化掉？1.酶学的产生:19世纪，胃肠消化与酒精发酵现象u 1684年，比利时医生Helment提出ferment 引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）。u 1833年，法国化学家Payen 和Persoz用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶（diastase）。u 1878年，德国科学家Kuhne提出enzyme从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”。1.酶学的产生酒精发酵u 19世纪，Pasteur和Liebig长期学术争论u法国化学家和微生物学家Pasteur认为没有生物则没有发酵。u 德国化学家Liebig认为发酵是由化学物质引起的u 此争议由德国学者Buchner兄弟于1896年

4、解决。小插曲如何解决？u 用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。u 证明：发酵与细胞的活动无关。Buchner试验uEnzyme：organic chemical substance(a catalyst)formed in living cells,able to cause changes in other substance without being changed itself.u酶：活细胞产生的，能催化底物转化为产物但自身不发生变化的有机物。u 酶的化学本质？2.酶学的迅速发展（理论研究）l1915年，德国化学家Willstatter因无法

5、准确检测而错误地宣称酶不是蛋白质。l1926年，美国康乃尔大学的“独臂学者”Sumner从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。l1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）结晶，确立了酶的化学本质。（1）酶的化学本质u现已鉴定出4000多种酶，其中数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。u 1890年，Fisher锁钥学说。u 1902年，Henri中间产物学说。u 1913年，Michaelis 和 Menten米氏学说。u 1958年，Koshland诱导契合学说。u 19

6、60年，Jacob 和 Monod操纵子学说。u酶：是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质。（2）酶学理论研究是否所有的酶都是蛋白质？u1982年，Thomas Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶Ribozyme。u1983年，Sidney Altman等发现核糖核酸酶P（RNase P）的RNA部分具有催化tRNA前体成熟的作用。u 二者共同获得1989年诺贝尔化学奖。（3）核酶的发现u 核酶的发现，改变了有关酶的概念，即：酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或核酸）。酶（Enzyme）天然酶 en

7、zyme 极端酶 extremozyme 抗体酶 abzyme 生物工程酶 bioengineering enzyme核酶 ribozyme脱氧核酶 deoxyribozyme核酸类酶ribozyme蛋白类酶Proteozyme（3）核酶的发现第二节 酶的催化作用一、酶的催化特性1.专一性高：催化一种或一类结构相似的底物（1）绝对专一性：催化一种底物p立体异构专一性：光学（DL）/几何（顺反）（2）相对专一性：催化一类结构相似的底物p键专一性p基团专一性一、酶的催化特性2.催化效率高o原因：降低反应活化能3.反应条件温和p原因：降低反应活化能，极端条件下易失活4.催化活性可调节p酶合成/酶活性

8、调节5.结合酶（P酶）的催化活性与辅因子有关o酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。o辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。P酶单纯酶结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子辅酶辅基p必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。p活性中心：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接相关的部位。必需基团活性中心活性中心外结合基团催化基团专一性催化性质二、酶的活性中心（active center）构象稳定三、酶的催化作用机制1.中间产物学说（central complex）2.锁钥学说（lock and key theory）3.诱导契合学说（induced-fit theory）4.群

9、体移动模式四、影响酶催化作用的因素1.底物浓度u高浓度底物抑制作用四、影响酶催化作用的因素2.酶浓度实际应用中，能否过分增加酶浓度？V=kE提高酶热稳定性的意义？四、影响酶催化作用的因素3.温度o最适温度o温度升高可提高反应 速度，一般低于60度o特例四、影响酶催化作用的因素4.pH值o最适pHo影响基团解离 状态如何维持酶在最适pH条件下作用？四、影响酶催化作用的因素5.抑制剂的影响o抑制剂：与酶结合并使其催化活性降低或丧失的物质o来源：细胞代谢产物、外源物质 与变性剂的区别？研究意义何在？u抑制剂的分类(1)不可逆抑制剂p抑制剂与酶以共价键方式结合，导致酶的活性损失，除去抑制剂后活性无法恢

10、复。(2)可逆抑制剂p抑制剂与酶以非共价键方式结合，导致酶的活性损失，除去抑制剂后活性可以恢复。5.抑制剂的影响(2)可逆抑制剂o根据抑制剂与酶分子结合部位分为：竞争性抑制（competitive inhibation）非竞争性抑制（noncompetitive inhibation）反竞争性抑制（uncompetitive inhibation）线性混合型抑制（linear mixed inhibation）Km、Vmax如何变化？(2)可逆抑制剂 竞争性抑制（competitive inhibation）p抑制剂：底物的结构类似物p酶与底物亲和力减小，Km增大p底物浓度足够大时，Vmax不

11、变 竞争底物结合位点(2)可逆抑制剂 非竞争性抑制（noncompetitive inhibation）o抑制剂：结构与底物无关o酶与底物间亲和力不变，Km不变o增大底物浓度无法逆转抑制作用，Vmax减小与底物分别结合在不同位点(2)可逆抑制剂 反竞争性抑制（uncompetitive inhibation）o抑制剂：酶与底物结合后，暴露其结合部位o酶与底物亲和力增大，Km减小o增大底物浓度无法逆转抑制作用，Vmax减小与酶-底物中间复合物结合(2)可逆抑制剂 线性混合型抑制（linear mixed inhibation）pKm、Vmax变化难以确定底物与酶结合后还可结合抑制剂，抑制剂与酶结

12、合后还可结合底物四、影响酶催化作用的因素6.激活剂的影响o激活剂：提高酶的催化活性或使其催化活性显示出来的物质o 来源：金属离子、无机离子、酶（酶原激活）o 分类：必需激活剂、非必需激活剂五、酶的活力1.酶活力（activity）o定义：一定条件下，酶催化某一化学反应的能力。o酶活力的表征：一定条件下催化的化学反应的反应速率o反应速率测定：检测单位时间内产物的生成量或底物的消耗量oV=-dS/dT=dP/dT2.酶活力单位(U)o国际单位（IU）：在最适条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量。o催量单位（kat）：在最适条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量。o1 ka

13、t=6107 IUo酶的比活力（specific activity）：一定条件下，每mg酶所具有的酶活力单位数（U/mg）表征酶纯度自定义，相对比较Please calculate the specific activity of enzyme after each step of purification,and the total efficiency of the purification process.Procedure or stepFractionVolume(ml)TotalProtein(mg)Activity(units)Specific activity(units/mg

14、)1.crude cellular1,40010,000100,000 2.precipitation with ammonium sulfate2803,00096,000 3.Ion-exchage chromatography9040080,000 4.Size-exclusionchromatography8010060,000 5.affinity chromatography6345,000 3.酶活力的测定3.酶活力的测定紫外吸收、显色放射性同位素标记底物酸碱滴定、pH电极量气法、酶偶联分析荧光性质小结o酶的催化特性o影响酶催化作用的因素：底物浓度 酶浓度 温度 pH 抑制剂（可

15、逆抑制剂）激活剂o酶活力的定义及测定第三节 酶工程发展概况酶工程（Enzyme Engineering）p利用酶或者含酶细胞（微生物、动物、植物）或细胞器作为生物催化剂，借助工程手段将相应的原料（底物）转化成有用物质（产物）的应用型生物高新技术。p酶的生产、改性和应用的技术。1.化学酶工程（初级酶工程）p酶学与化学工程技术相结合的产物。p研究内容：固定化酶与固定化细胞、酶分子修饰、非水相酶催化、酶反应器等。p抗体酶：具有催化作用的抗体。p模拟酶：人工合成的具有活性中心和催化作用 的非蛋白质结构的化合物。一、酶工程简介 2.生物酶工程（高级酶工程）p在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与基因工程技

16、术相结合的产物。p基因工程酶：（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）（2）用蛋白质工程技术改变酶结构基因（突变酶、进 化酶）（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性 能稳定、活性更高的新酶。一、酶工程简介生物酶工程示意图酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图选择性修饰方案突变酶 新酶克隆酶产品效用发展酶基因遗传设计遗传修饰DNA重组技术DNA重组技术1.酶的生产及应用 1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶用作消化剂，开创了酶技术走向商业化的先例。1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。二、酶工程研究简史（应用研究）二、酶工程研究简史（应用研究）o1

17、908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。o1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。o20世纪前几十年，酶蛋白的研究技术没有突破，酶工程研究进展缓慢。仅限于酶的提取与小规模应用p微生物发酵产酶第二次世界大战后，随着微生物培养技术、发酵技术和提取技术的渐渐完善，利用微生物来获得商品化酶制剂形成规模化产业酶的生产p动植物细胞培养产酶 20世纪80年代培养技术的发展，成为酶生产的又一重要途径。酶的大规模生产与广泛应用 稳定性差 分离纯化工艺复杂 生产成本较高，不能重复使用二、酶工程研究简史（应用研究）2.酶的改造及应用 p 限制自然酶工业应用

18、的原因：p 改造：化学酶工程二、酶工程研究简史（应用研究）化学酶工程 p 上世纪50年代-80年代：固定化酶、固定化细胞、固 定化原生质体研究p 上世纪60年代-70年代：酶分子化学修饰技术的发展p 抗体酶、人工酶、模拟酶。酶的改造与广泛应用o20世纪90年代：利用基因工程技术，经过酶基因重组，在微生物上表达由动物或植物生产的酶。3.基因工程、酶工程、发酵工程的结合o由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程发酵工艺先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。o改造：生物酶工程o克隆酶、突变酶、定向进化酶。三、酶的应用现状p食品工业p轻工、化工p医药p环境保护p生物技术绿色健康，“

19、酶”力无限医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域 1.酶在食品工业的应用（1）淀粉糖加工p 果葡糖浆的生产（2）乳品加工o乳糖/蛋白水解o酸奶/奶酪生产1.酶在食品工业的应用（3）果汁生产p果汁果酒的澄清：果胶酶1.酶在食品工业的应用1.酶在食品工业的应用o鱼、肉制品加工o油脂改良o酒类酿造o食品烘焙o食品添加剂生产2.酶在化工、轻工领域的应用o原料处理o生产各种轻工、化工产品o增强产品的使用效果 生物抛光是一种用纤维素酶改善纤维素纤维制品表面的整理工艺，以达到持久的抗起毛起球并增加织

20、物的光洁度和柔软度。SOD3.酶在医药领域的应用o疾病诊断o疾病治疗o药物生产通过酶活力变化进行疾病诊断酶酶疾病与酶活力变化疾病与酶活力变化淀粉酶淀粉酶胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降胆碱酯酶胆碱酯酶肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降碱性磷酸酶碱性磷酸酶佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降升高；软骨发育不全等，活力下降谷丙转氨酶谷丙转氨酶/谷谷草转氨酶草转氨酶肝病、心肌梗塞等，活力升高肝病、心肌梗塞等，活力升高-谷氨

21、酰转肽谷氨酰转肽酶（酶（-GT）原发性和继发性肝癌，活力增高至原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，阻塞性单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中酶活力升高黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中酶活力升高胃蛋白酶胃蛋白酶胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显著升高；肝硬化，肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显著升高；肝硬化，活力正常活力正常端粒酶端粒酶癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性脂肪酶脂肪酶急性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌、胆管炎患者，活急

22、性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌、胆管炎患者，活力升高力升高用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断 酶酶测定的物质测定的物质用用 途途葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿测定血糖、尿糖，诊断糖尿病病葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶+过氧化过氧化物酶物酶葡萄糖葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿测定血糖、尿糖，诊断糖尿病病尿素酶尿素酶尿素尿素测定血液、尿液中尿素的量，测定血液、尿液中尿素的量，诊断肝脏、肾脏病变诊断肝脏、肾脏病变谷氨酰胺酶谷氨酰胺酶谷氨酰胺谷氨酰胺测定脑脊液中谷氨酰胺的量，测定脑脊液中谷氨酰胺的量，诊断肝昏迷、肝硬化诊断肝昏迷、肝硬化胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶胆固醇胆固醇测定胆

23、固醇含量，诊断高血测定胆固醇含量，诊断高血脂等脂等DNA聚合酶聚合酶基因基因通过基因扩增，基因测序，通过基因扩增，基因测序，诊断基因变异、检测癌基因诊断基因变异、检测癌基因疾病治疗方面的应用酶酶来来 源源用用 途途淀粉酶淀粉酶胰脏、麦芽、微生物胰脏、麦芽、微生物 治疗消化不良，食欲不振治疗消化不良，食欲不振溶菌酶溶菌酶蛋清、细菌蛋清、细菌治疗各种细菌性和病毒性疾病治疗各种细菌性和病毒性疾病尿激酶尿激酶人尿人尿治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血出血链激酶链激酶链球菌链球菌治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折出血，骨折L-天冬

24、酰胺天冬酰胺酶酶大肠杆菌大肠杆菌治疗白血病治疗白血病超氧化物歧超氧化物歧化酶化酶微生物，植物，动物微生物，植物，动物 预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎炎，结肠炎凝血酶凝血酶动物，蛇，细菌，酵动物，蛇，细菌，酵母等母等治疗各种出血病治疗各种出血病溶纤酶溶纤酶蚯蚓蚯蚓溶血栓溶血栓核糖核酸酶核糖核酸酶胰脏胰脏抗感染，祛痰，治肝癌抗感染，祛痰，治肝癌溶菌酶药物制造方面的应用 酶酶主要来源主要来源用途用途青霉素酰化酶青霉素酰化酶微生物微生物制造半合成青霉素和头孢制造半合成青霉素和头孢菌素菌素11-羟化酶羟化酶霉菌霉菌制造氢化可的松制造氢化可的松-酪氨酸酶酪氨酸酶

25、植物植物制造多巴制造多巴-甘露糖苷酶甘露糖苷酶链霉菌链霉菌制造高效链霉素制造高效链霉素核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶微生物微生物生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷（阿糖腺苷）（阿糖腺苷）酰基氨基酸水解酶酰基氨基酸水解酶微生物微生物生产生产L-氨基酸氨基酸5-磷酸二酯酶磷酸二酯酶桔青霉等微生物桔青霉等微生物生产各种核苷酸生产各种核苷酸核糖核酸酶核糖核酸酶微生物微生物生产核苷酸生产核苷酸蛋白酶蛋白酶动物、植物、微生物动物、植物、微生物生产生产L-氨基酸氨基酸-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶黑曲霉等微生物黑曲霉等微生物生产人参皂甙生产人参皂甙-Rh2青霉素酰化酶与抗生素改造4.酶在环境保护中的应用o环境监

26、测o废水处理n过氧化物酶n多酚氧化酶o可降解材料开发5.酶在生物技术方面的应用o细胞破壁o分子切割限制性内切酶o分子连接DNA连接酶o反转录酶oTaq DNA聚合酶基因工程的基础！p 现代基因工程创始人P伯格p1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶连接起来，产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接。基因工程技术的诞生1980年诺贝尔化学奖DNA 连接酶“分子针线”限制性内切酶 “分子手术刀”CRISPR-Cas 9NgAgo-gDNA 部分限制性核酸内切酶的来源与作用位点酶酶识别序列与作用位点识别序列与作用位点53来来 源源Al

27、u AGCTArthrobacter luteusAvaCPyCGPuGAnabaena vayiabilisBamH GGATCCBacillus amyloliquefaciensBgl AGATCTBacillu globigiiEco R GAATTCEscherichia coli Rye13Hae GGCCHacmophilus aegyptiusHind AAGCTTHaemophilus influenzaeKpn GGTACCKlebsiella pneumoniaePst CTGCAGProvidencia stuartiiSal GTCGACStreptomyces albusSma CCCGGGSerratia marcensXba TCTAGAXanthomonas badriiXho CTCGAGXanthomonas holicola四、酶工程的发展趋势新酶发现o从新生物资源中发掘新酶（极端环境生物资源）o依靠微生物基因组测序结果发现新酶o借助定向进化和DNA重排技术创造新酶学习酶工程的意义何在？1.简述酶的组成、分类、催化特性及影响因素。2.简述酶活力单位的概念及酶活力的测定方法。3.试述酶工程的概念及研究内容。思考题