(4.5)--第三章酶的提取与分离纯化.ppt

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1、酶的分离工程酶的分离工程u 将酶从生物细胞或培养物等含酶原料将酶从生物细胞或培养物等含酶原料中中提取提取出来，再与杂质出来，再与杂质分开分开，从而获得能，从而获得能够满足使用需求的一定够满足使用需求的一定纯度纯度的酶的过程。的酶的过程。u预处理预处理（pretreatment）：包括发酵液性质改变和固液：包括发酵液性质改变和固液分离等。分离等。u酶的提取（酶的提取（extraction）：酶充分转入溶剂的过程。酶充分转入溶剂的过程。u粗分级分离（粗分级分离（roughfractionation）：除去与目的产物：除去与目的产物性质差异较大的杂质。性质差异较大的杂质。u细分级分离（细分级分离（f

2、inefractionation）：除去与产物性质：除去与产物性质相似的杂质。相似的杂质。u浓缩、干燥与结晶浓缩、干燥与结晶（concentration,desiccationandcrystalization）（成品加工）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。使酶与溶剂分离的过程。第三章第三章酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化本章内容本章内容l发酵液的预处理发酵液的预处理l酶的提取酶的提取l酶的分离纯化酶的分离纯化l成品加工成品加工l 酶分离纯化方案的设计与评价酶分离纯化方案的设计与评价第一节第一节发酵液的预处理发酵液的预处理发酵液的成分：发酵液的成分：l细胞个体及碎片细胞个体及碎片l未利用

3、的培养基未利用的培养基l细胞代谢产物细胞代谢产物预处理的目的：预处理的目的：l改变发酵液的物理性质改变发酵液的物理性质l除去部分杂质除去部分杂质黏度高，杂质多，黏度高，杂质多，酶含量酶含量低且不稳定低且不稳定一、发酵液的预处理一、发酵液的预处理1.影响发酵液固液分离的因素（过滤为主）影响发酵液固液分离的因素（过滤为主）l细胞类型细胞类型l发酵液的黏度发酵液的黏度二、发酵液的固液分离二、发酵液的固液分离二、发酵液的固液分离二、发酵液的固液分离2.固液分离的目的固液分离的目的l胞外酶胞外酶：除去固体杂质和细胞，收集：除去固体杂质和细胞，收集水相水相l胞内酶胞内酶：除去水相，收集：除去水相，收集细胞

4、细胞3.固液分离的常用方法固液分离的常用方法l过滤过滤l离心离心l膜分离膜分离一、一、细胞破碎细胞破碎二、酶的提取二、酶的提取第二节第二节酶的提取酶的提取（一）细胞壁及细胞膜组成（一）细胞壁及细胞膜组成细胞壁细胞壁的主要成分：的主要成分：l细菌：肽聚糖（细菌：肽聚糖（N-乙酰葡糖胺，乙酰葡糖胺，N-乙酰胞壁酸）、乙酰胞壁酸）、脂质脂质l酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质l霉菌：多糖（几丁质和葡聚糖）霉菌：多糖（几丁质和葡聚糖）l植物细胞：纤维素和果胶植物细胞：纤维素和果胶l动物细胞：动物细胞：细胞膜细胞膜（磷脂双分子层）（磷脂双分子层）一、细胞破碎（胞内酶）一、细胞破

5、碎（胞内酶）l 机械破碎法机械破碎法 l 物理破碎法物理破碎法l 化学破碎法化学破碎法 l 酶促破碎法酶促破碎法l 微波破碎法微波破碎法l 可联用可联用（二）细胞破碎的方法（二）细胞破碎的方法1.机械破碎法机械破碎法u匀浆法匀浆法u捣碎法捣碎法u研磨法研磨法（二）细胞破碎的方法（二）细胞破碎的方法2.物理破碎法物理破碎法l超声波法超声波法l压力差法压力差法渗透压变化法渗透压变化法高压冲击法高压冲击法突然降压法突然降压法l温度差法温度差法：反复低温冰冻，室温融化。：反复低温冰冻，室温融化。（二）细胞破碎的方法（二）细胞破碎的方法细胞细胞 超声超声 机械机械 渗透压渗透压 温度温度动植物动植物 +

6、革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 +革兰氏阳性芽孢菌革兰氏阳性芽孢菌 +酵母酵母 +革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌 +-+-+菌丝菌丝 -+-+-+-+孢子孢子 -细胞对破碎方法的敏感性细胞对破碎方法的敏感性3.化学破碎法化学破碎法u应用各种应用各种化学试剂化学试剂与与细胞膜细胞膜作用，使细胞膜结构作用，使细胞膜结构改变或破坏。改变或破坏。u有机溶剂有机溶剂：破坏磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯：破坏磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。仿等。u表面活性剂表面活性剂：与磷脂和脂蛋白作用，常用：与磷脂和脂蛋白作用，常用非离子非离子型表面活性剂型表面活性剂，如，如TritonX-100，Tween等。等。（二）细胞

7、破碎的方法（二）细胞破碎的方法低温下，防止变性！低温下，防止变性！4.酶促破碎法酶促破碎法l自溶法自溶法：细胞结构在本身具有的各种：细胞结构在本身具有的各种水解酶水解酶作用作用下发生溶解的现象。下发生溶解的现象。l外加酶法外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。适当的酶。如何根据细胞壁特如何根据细胞壁特点选择酶？点选择酶？（二）细胞破碎的方法（二）细胞破碎的方法 例：细菌细胞壁的结构例：细菌细胞壁的结构破壁时需加破壁时需加EDTA溶菌酶溶菌酶1.直接测定破碎前后的细胞数直接测定破碎前后的细胞数：u破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接破碎前，用显微镜

8、或电子微粒计数器直接计数计数；破碎后，用破碎后，用染色法染色法区分破碎细胞与完整细胞。区分破碎细胞与完整细胞。2.测定导电率测定导电率：u利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。3.测定释放的蛋白质量或酶活力测定释放的蛋白质量或酶活力：u测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。算破碎率。（三）细胞破碎确认（三）细胞破碎确认小结：细胞破壁方法及原理小结：细胞破壁方法及原理l酶的抽提酶的抽提：在一定条件下，用适当的溶剂处理：在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶含酶原料，使酶充分溶入溶剂充分溶入溶剂的过

9、程。的过程。l目标目标：将目的酶：将目的酶最大限度地溶解最大限度地溶解出来；保持出来；保持生生物活性物活性。l注意注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用活，一般采用低温（低温（010）操作。操作。l原则原则：相似相溶相似相溶；远离等电点的远离等电点的pH值值二、酶的提取（二、酶的提取（extraction）（1）盐溶液提取法（盐溶，）盐溶液提取法（盐溶，saltingin）u常用常用低浓度盐溶液低浓度盐溶液（0.02-0.5mol/L，常用，常用NaCl、磷酸盐等），对酶稳定性好、溶解度大磷酸盐等），对酶稳定性好、溶解度大。1.提取方法提取方法

10、1.提取方法提取方法（2）酸、碱溶液提取法）酸、碱溶液提取法l在酸（在酸（pH2-6）、碱（）、碱（pH8-12）溶液中）溶液中溶解度溶解度大、稳定性好大、稳定性好的酶的酶（3）有机溶剂提取法）有机溶剂提取法l与与脂质脂质结合或含有较多结合或含有较多非极性基团非极性基团的酶的酶l有机溶剂（有机溶剂（与水互溶与水互溶）：低级醇、丙酮、苯）：低级醇、丙酮、苯酚酚2.影响提取的主要因素影响提取的主要因素（1）温度）温度u温度升高，酶的溶解度增加，溶解速率加快温度升高，酶的溶解度增加，溶解速率加快u温度过高，酶易变性失活温度过高，酶易变性失活u低温提取低温提取：一般：一般0-10摄氏度摄氏度（2）pH

11、u远离等电点远离等电点，防止酶沉淀，防止酶沉淀u不宜过高过低不宜过高过低，防止变性失活，防止变性失活（3）提取液体积）提取液体积uu 原料体积的原料体积的3-5倍倍为宜，不宜过多为宜，不宜过多其他因素：其他因素：搅拌、时间、搅拌、时间、保护剂等保护剂等小结：酶的提取方法小结：酶的提取方法第第三三节节酶的酶的分离纯化分离纯化一、沉淀分离一、沉淀分离二、离心分离二、离心分离三、过滤与三、过滤与膜分离膜分离四、层四、层析析分离分离五、电泳技术五、电泳技术一、沉淀分离（根据溶解度的不同）一、沉淀分离（根据溶解度的不同）u初步分离初步分离：使酶（或杂质）由：使酶（或杂质）由液相液相转变为转变为固固相相析

12、出析出u常用方法常用方法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法选择性变性沉淀法（热变性和酸碱变性）选择性变性沉淀法（热变性和酸碱变性）等电点沉淀法等电点沉淀法其他沉淀法其他沉淀法（一）盐析沉淀法（一）盐析沉淀法1.盐析（盐析（saltingout）：高浓度的中性盐高浓度的中性盐降低蛋白降低蛋白质的溶解度。质的溶解度。稳定因素：稳定因素：水化膜、表面水化膜、表面电荷电荷l常用：硫酸盐、氯化钠、磷酸盐等常用：硫酸盐、氯化钠、磷酸盐等l盐浓度的调整（以硫酸铵为例）盐浓度的调整（以硫酸铵为例）饱和溶液法饱和溶液法：滴加：滴加饱和硫酸铵溶液饱和硫酸铵溶液固体盐添加法固体盐添加法：添加：添加硫酸铵固体硫

13、酸铵固体l注意：盐析得到的沉淀再溶解后应用超滤注意：盐析得到的沉淀再溶解后应用超滤（ultrafiltration）、透析（、透析（dialysis）或层析）或层析（chromatography）方法）方法脱盐脱盐。1.盐析过程盐析过程u分段盐析：分段盐析：不同蛋白质分子量、不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析不同蛋白质先后析出出。1.盐析过程盐析过程2.盐析的影响因素盐析的影响因素uS：离子强度为：离子强度为I时的蛋白质的溶解度时的蛋白质的溶解度（g/L）uS0：离子强度为：离子强度为0时蛋白质

14、的溶解度时蛋白质的溶解度（g/L）uKs：盐析常数：盐析常数，与，与蛋白质蛋白质和和盐种类盐种类有关的特性常有关的特性常数。数。uKs代表盐析效率代表盐析效率，表示随着盐浓度的增加蛋白质，表示随着盐浓度的增加蛋白质溶解度降低的速度，溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好越大盐析效果越好。离子强度离子强度蛋白质浓度蛋白质浓度：l过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。最好。pH值值：l等电点等电点处最易沉淀。处最易沉淀。温度温度：l一般可在一般可在室温室温下进行，某些对温度敏感的酶可下进行，某些对温度敏感的酶可在在低温低温下操作下操作。2.盐析的影响因

15、素盐析的影响因素l利用酶与杂质在利用酶与杂质在有机溶剂中的溶解度不同有机溶剂中的溶解度不同而使之而使之分离的方法。分离的方法。1.沉淀机理沉淀机理l降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数l部分地引起蛋白质脱水部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂（与水互溶）常用有机溶剂（与水互溶）l丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般为酶液体积的甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左倍左右。右。（二）（二）有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法3.作用特点作用特点：l优点优点：分辨率比盐析法高分辨率比盐析法高沉淀不需脱盐沉淀不需脱盐溶剂易挥发，沉淀易分离溶剂易挥发，沉淀易分离l缺点缺点：容易引起蛋白质变性失活，必须容易引起蛋白质变

16、性失活，必须低温操作，沉淀低温操作，沉淀后立即用水或缓冲液溶解后立即用水或缓冲液溶解有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。（二）（二）有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法4.影响因素影响因素 温度温度l低温低温，有机溶剂预冷，有机溶剂预冷pHl等电点等电点附近附近蛋白质浓度蛋白质浓度1.原理原理l蛋白质在等电点时蛋白质在等电点时溶解度最低溶解度最低l不同的蛋白质具有不同的蛋白质具有不同的等电点不同的等电点2.使用方法使用方法l边边滴滴加加边边搅搅拌拌，防防止止局局部部过过酸酸过过碱碱引引起起酶酶分分子变性子变性（三）（三）等电点沉淀法等电点沉淀法单独使用等电点沉淀法能

17、否使目的蛋白从反应单独使用等电点沉淀法能否使目的蛋白从反应体系中完全沉淀出来？体系中完全沉淀出来？可以可以不可以不可以AB提交u单单独独使使用用较较少少（用用于于从从粗粗酶酶液液中中除除去去某某些些等等电电点相距较大的点相距较大的杂蛋白杂蛋白）u多多与与其其它它方方法法联联合合使使用用（如如盐盐析析法法、有有机机溶溶剂剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。单选题单选题 1分分l选择一定的条件使溶液中存在的某些选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变杂蛋白质变性性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。沉淀而不影响所需蛋白质的方法。1.热变性（耐高温酶）热

18、变性（耐高温酶）l加热使改变蛋白结构，破坏水化层，使加热使改变蛋白结构，破坏水化层，使杂蛋白变杂蛋白变性沉淀性沉淀而保留目的酶在溶液中。而保留目的酶在溶液中。2.pH变性变性l改变体系改变体系pH值使杂蛋白变性值使杂蛋白变性3.有机溶剂变性有机溶剂变性l使对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。使对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。（四）选择性变性沉淀法（四）选择性变性沉淀法1.作用机理作用机理u与有机溶剂类似与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。，是发展较快的一种新方法。2.沉淀剂：非离子有机聚合物和聚电解质沉淀剂：非离子有机聚合物和聚电解质u常用：常用：聚乙二醇聚乙二醇（Polyethyenegly

19、col，简写，简写PEG），多用分子量大于），多用分子量大于4000的的PEG。3.优点优点l操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。l沉沉淀淀效效能能高高，使使用用少少量量的的PEG即即可可沉沉淀淀相相当当多多的生物大分子。的生物大分子。（五）其他沉淀法（复合沉淀法）（五）其他沉淀法（复合沉淀法）小结：酶的沉淀分离小结：酶的沉淀分离l借助于离心机产生的借助于离心机产生的离心力离心力分离分离不同大小、不不同大小、不同密度同密度的物质的物质（一）基本原理（一）基本原理1.离心力离心力uFc=mac=mr2=mr(2 N/60)2uN为离心机每分钟转数为离心机每

20、分钟转数（r/min，rpm）表示方法一表示方法一二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）uFc通常以通常以相对离心力相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力）表示，即离心力F的大小相当于地球引力的大小相当于地球引力（重力）的多少倍，一般用（重力）的多少倍，一般用g（或（或数字数字 g）表示）表示uRCF=mr（2 N/60）2/mg=1.12 10-5N2ru此公式描述了此公式描述了相对离心力相对离心力与与转速转速N之间的关系之间的关系u低速离心：以每分钟的转数表示低速离心：以每分钟的转数表示，如：，如：4000rpmu高速离心（超

21、速）：常以相对离心力（高速离心（超速）：常以相对离心力（RCF）表示）表示，如：如：65000g。表示方法二表示方法二二者如何选择？二者如何选择？二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）2.沉降系数（沉降系数（sedimentationconstant）u单位离心力下颗粒的沉降时间，用单位离心力下颗粒的沉降时间，用S表示。表示。u与与分子量、分子密度分子量、分子密度成正比成正比u由于许多生物大分子的由于许多生物大分子的S值很小，所以定义值很小，所以定义10 13s为一个沉降单位，为一个沉降单位，1S=1 10 13s。u常用常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的表示某些

22、生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在，蛋白质的沉降系数一般在1200之间。之间。二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）（二）离心机的种类（二）离心机的种类二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）名称名称转速转速(r/min，g)注意事项注意事项低速离心机低速离心机 8000 1104常温，注意样品热变性和常温，注意样品热变性和离心管平衡离心管平衡高速离心机高速离心机8000-250001104-1105冷冻（防止温度升高），冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡离心管的精确平衡超速离心机超速离心机2500011

23、05冷冻真空系统（减少空冷冻真空系统（减少空气阻力和摩擦），气阻力和摩擦），离心管的精确平衡离心管的精确平衡实验室离心机实验室离心机l温度类型温度类型：常温及冷冻常温及冷冻 使用冷冻离心机时提前使用冷冻离心机时提前降温降温，预冷离心头。，预冷离心头。l离心机的大小离心机的大小：落地式及台式：落地式及台式二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）（三）离心的形式（三）离心的形式l角式角式l水平式水平式二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）离心头（转子）离心头（转子）l角式离心头要角式离心头要配套配套，低温使用要，低温使用要预冷预冷，操作注意，操作注意稳、盖、旋

24、紧稳、盖、旋紧。二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）使用离心机时，应注意：使用离心机时，应注意：平衡平衡定温定温定速定速定时定时ABCD提交提交（四）（四）离心机操作离心机操作多选题多选题1分分（五）常用离心方法（五）常用离心方法差速离心差速离心沉降速度法沉降速度法密度梯度离心密度梯度离心沉降平衡法：等密度梯度离心沉降平衡法：等密度梯度离心常用，各类离心机均可常用，各类离心机均可超速离心超速离心二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）u低速低速与与高速高速离心交替进行，使离心交替进行，使沉降系数不同沉降系数不同的颗的颗粒分批分离的方法。粒分批分离的方法。

25、u适用：适用：分离分离分子量和密度差异较大分子量和密度差异较大的颗粒。的颗粒。u优点：优点：操作简单操作简单。u缺点：缺点：1）分离效果较差，）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒不能一次得到纯颗粒2）壁效应严重，沉降的颗粒受到挤压）壁效应严重，沉降的颗粒受到挤压。u用途用途：粗制品提取粗制品提取1差速离心差速离心（differentialcentrifugation）差速离心实例差速离心实例不同离心时间离心效果示意图不同离心时间离心效果示意图（a）离心前的悬浮液）离心前的悬浮液（b）（）（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况）离心不同时间后颗粒的沉降情况u又称又称速度区带离心速度区带离心u样品在样品

26、在密度梯度介质密度梯度介质中进行离心，使各组分得中进行离心，使各组分得以分离的一种以分离的一种区带分离方法区带分离方法。u密度梯度介质密度梯度介质：梯度介质溶解在一定的溶剂中，：梯度介质溶解在一定的溶剂中，从而在离心管内形成一定的从而在离心管内形成一定的密度梯度密度梯度。u常用密度梯度溶液：常用密度梯度溶液：蔗糖蔗糖溶液，梯度预先配制。溶液，梯度预先配制。适用于超速离心机适用于超速离心机2.密度梯度离心（密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）u步骤步骤：形成密度梯度，加样，离心，收集样品：形成密度梯度，加样，离心，收集样品2.密度梯度离心（密度梯度离心（de

27、nsitygradientcentrifugation）密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图u特点：特点：区带内的液相介质密度范围区带内的液相介质密度范围小于小于样品物质样品物质颗粒的密度。颗粒的密度。u适用适用：分离：分离密度相近而大小不同密度相近而大小不同的物质。的物质。u控制控制：在：在分子量最大的颗粒沉淀之前分子量最大的颗粒沉淀之前停止离心，停止离心，可适当可适当增大离心力增大离心力，减少离心时间减少离心时间，防止区带扩，防止区带扩散散u用途用途：分离核酸、蛋白质、核糖体亚基等成分：分离核酸、蛋白质、核糖体亚基等成分2.密度梯度离心（密度梯度离心（densitygradientcent

28、rifugation）2.密度梯度离心（密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）u又称又称沉降平衡离心沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。u离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时相同的密度时不再移动不再移动，形成，形成区带区带。u常用密度梯度溶液：常用密度梯度溶液：铯盐溶液铯盐溶液，梯度自发形成。，梯度自发形成。适用于超速离心机适用于超速离心机3.等密度梯度离

29、心等密度梯度离心 l特点：特点：区带内的液相介区带内的液相介质密度范围质密度范围包含包含样品物样品物质颗粒的密度质颗粒的密度l适用：适用：分离分离大小相近而大小相近而密度不同密度不同的物质的物质l控制：控制：离心速度和时间离心速度和时间应应足够长足够长3.等密度梯度离心等密度梯度离心 二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）（六）离心条件的确定（六）离心条件的确定u离心力离心力：RCF=1.12 10-5N2ru离心时间离心时间：t=K/S转子因子：转子因子：K=(lnr2-lnr1)/2=Stt：沉降时间（：沉降时间（s）S：颗粒沉降系数：颗粒沉降系数：转子角速度：转子角速

30、度u温度温度：多为：多为4摄氏度摄氏度upH：酶稳定，无腐蚀：酶稳定，无腐蚀二、离心分离（二、离心分离（centrifugation）u过滤过滤：借助：借助过滤介质过滤介质将不同将不同大小、形状和特性大小、形状和特性的物质进行分离的技术。的物质进行分离的技术。u分类分类：非膜过滤非膜过滤：粗滤、微滤：粗滤、微滤膜过滤膜过滤：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析三、过滤与膜分离三、过滤与膜分离过滤的分类及特性过滤的分类及特性三、过滤与膜分离三、过滤与膜分离1.非膜过滤非膜过滤l采用采用高分子膜以外的材料高分子膜以外的材料（滤纸、滤布、纤维、（滤纸、滤布、纤维、多孔陶

31、瓷、烧结金属等）作为过滤介质的分离多孔陶瓷、烧结金属等）作为过滤介质的分离技术技术2.膜过滤膜过滤l采用一定孔径的采用一定孔径的高分子薄膜高分子薄膜作为过滤介质的分作为过滤介质的分离技术离技术l分类分类：加压膜分离：微滤、超滤、反渗透加压膜分离：微滤、超滤、反渗透电场膜分离：电渗析、离子交换电渗析电场膜分离：电渗析、离子交换电渗析扩散膜分离：透析扩散膜分离：透析（1）加压膜分离）加压膜分离 微滤微滤：微孔滤膜微孔滤膜l特点特点：截留直径为：截留直径为0.2-2m的颗粒的颗粒过滤除菌常用过滤除菌常用（1）加压膜分离）加压膜分离 超滤超滤：超滤膜超滤膜u特点特点：截留直径为：截留直径为20 -0.

32、2m的颗粒的颗粒超滤装置超滤装置实验室装置实验室装置超滤装置超滤装置工业装置工业装置l中空纤维系统中空纤维系统l超滤膜包超滤膜包超滤装置超滤装置反渗透：反渗透：反渗透反渗透膜膜u在在高于溶液渗透压高于溶液渗透压的作用下，依据其他物质不能的作用下，依据其他物质不能透过半透膜而将其分离的技术。透过半透膜而将其分离的技术。u特点特点：截留直径：截留直径20 的颗粒的颗粒2.电场膜分离电场膜分离l使小分子的带电物质或离子在使小分子的带电物质或离子在电场作用电场作用下移动下移动并透过并透过半透膜半透膜的分离技术的分离技术（1）电渗析）电渗析（2）离子交换膜电渗析）离子交换膜电渗析脱盐脱盐3.扩散膜分离扩

33、散膜分离透析（透析（dialysis）u 利用利用分子扩散分子扩散作用使溶质分子从高浓度一侧通作用使溶质分子从高浓度一侧通过过透析膜透析膜向低浓度一侧移动的分离技术向低浓度一侧移动的分离技术u 主要用于主要用于除盐除盐（1）透析膜透析膜u特点：特点：多孔薄膜多孔薄膜，允许小分子通过，阻止大分子通过，允许小分子通过，阻止大分子通过化学惰性化学惰性，多种溶液中不溶解（材料：纤维素衍，多种溶液中不溶解（材料：纤维素衍生物等）生物等）一定的一定的机械强度机械强度u透析膜规格选择：透析膜规格选择：截留分子量（范围）、压平宽截留分子量（范围）、压平宽度度（2）透析方法及装置）透析方法及装置u 色谱起源色谱

34、起源色谱色谱组分组分植物色素植物色素石油醚石油醚碳酸钙颗粒碳酸钙颗粒u用用色彩色彩（chroma）和）和图谱图谱（graphs）组成）组成色谱色谱一一词（词（Chromatography)。四、四、层析层析分离（色谱法，分离（色谱法，Chromatography）四、层析分离四、层析分离l利用各组分的利用各组分的理化性质理化性质的不同，使各组分以不的不同，使各组分以不同比例分布在同比例分布在两相（固定相、流动相）两相（固定相、流动相）中，当中，当流动相流经固定相时，流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移各组分以不同的速度移动动，从而使不同组分得到分离纯化的技术。，从而使不同组分得到分离纯化的

35、技术。l理化性质理化性质：相对分子质量、形状、吸附力、亲：相对分子质量、形状、吸附力、亲和力、分配系数、等电点等和力、分配系数、等电点等柱层析（柱层析（ColumnChromatography）自动核酸蛋白自动核酸蛋白液相色谱分析仪液相色谱分析仪自动核酸蛋白自动核酸蛋白液相色谱分析仪液相色谱分析仪u 蠕动泵（恒流泵）蠕动泵（恒流泵）u 层析柱层析柱u 紫外检测仪紫外检测仪u 记录仪记录仪u 部分收集器部分收集器 低低温温层层析析柜柜现代化层析设备现代化层析设备AKTA记录系统记录系统良好的线性放大良好的线性放大四、层析分离四、层析分离l凝胶层析凝胶层析l离子交换层析离子交换层析l疏水层析疏水层

36、析l吸附层析吸附层析l亲和层析亲和层析l蛋白液相层析蛋白液相层析l层析聚焦层析聚焦u又称又称凝胶过滤层析凝胶过滤层析、凝胶渗透层析凝胶渗透层析、分子筛分子筛层析层析、分子排阻层析分子排阻层析等等u以各种以各种多孔凝胶多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组为固定相，利用溶液中各组分的分的分子质量、形状不同分子质量、形状不同而进行分离的技术。而进行分离的技术。（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelchromatography）1.基本原理基本原理u大分子物质大分子物质：不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之：不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并间的空隙向下移动，并最先流出层析柱最先流出层析柱u小分子

37、物质小分子物质：可自由出入凝胶孔，流程长：可自由出入凝胶孔，流程长而后流而后流出层析柱出层析柱（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelchromatography）（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelchromatography）u凝胶对溶质的排阻程度可用凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数分配系数Ka表示：表示：Ve-VoKa=ViuVo：外水体积：外水体积，层析柱内，层析柱内凝胶颗粒之间空隙凝胶颗粒之间空隙的体积的体积uVi：内水体积：内水体积，层析柱内，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔凝胶颗粒内部各微孔体积体积的总和的总和uVe：某组分的洗脱体积：某组分的洗脱体积，从，从加进层析柱到流出层析加进层析柱

38、到流出层析柱，且色谱峰达到最高值时柱，且色谱峰达到最高值时的洗脱液体积的洗脱液体积（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelchromatography）u凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰：.Ka=0，即即Ve=Vo：说说明明该该组组分分分分子子量量足足够够大大，不不进进入入微微孔孔，最最先先流出流出。.Ka=1，即即Ve=Vo+VI：说说明明该该组组分分能能进进入入凝凝胶胶的的全全部部内内空空隙隙，最最后流出后流出。.0Ka1?体系中存在其他层析（吸附层析、体系中存在其他层析（吸附层析、离子交换层析等）离子交换层析等）（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelchromatograp

39、hy）2.凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质多孔网状结构多孔网状结构u交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（dextrangel)u琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（agarosegel)u聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelchromatography）3.凝胶过滤层析的操作凝胶过滤层析的操作（1）凝胶的选择和处理）凝胶的选择和处理（2）层析柱的选择）层析柱的选择（3）装柱）装柱（4）上柱）上柱（5）洗脱）洗脱（6）胶的保存）胶的保存（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelchromatography）91（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelch

40、romatography）4.应用应用u 脱盐脱盐u 溶液浓缩溶液浓缩 u 生物大分子物质的分离纯化生物大分子物质的分离纯化u 分子量的测定分子量的测定（一）凝胶层析（一）凝胶层析（gelchromatography）u利用利用离子交换剂离子交换剂上的上的可解离基团可解离基团对各离子的对各离子的亲亲和力和力不同进行分离的技术。不同进行分离的技术。（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）1.基本原理基本原理（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）2.离子交换剂离子交换剂u由由载体载

41、体、可解离基团可解离基团（电荷基团电荷基团和和反离子反离子）构成）构成纤维素纤维素琼脂糖琼脂糖葡聚糖葡聚糖树脂树脂载体载体电荷基团电荷基团OCH2COO-H+反离子反离子（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）（1）离子交换剂的类型）离子交换剂的类型阴离子交换剂：阴离子交换剂：l二乙氨基乙基二乙氨基乙基DEAEC2H4N+(C2H5)2Hl二乙氨基乙基二乙氨基乙基2-羟丙基羟丙基QAEC2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3阳离子交换剂：阳离子交换剂：l羧甲基羧甲基CMCH2COOl磺丙基磺丙基SPC3H6SO3（二）离子交换

42、层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）化学原料合成：树脂类物质化学原料合成：树脂类物质载体载体天然材料制成：天然材料制成：cellulose、sephadex、sepharose阳离子交换剂：电荷基团（）阳离子交换剂：电荷基团（）,反离子（）反离子（）可解离可解离基团基团阴离子交换剂：电荷基团（）阴离子交换剂：电荷基团（）,反离子（）反离子（）例：例：DEAE-Sephadex，CM-Sepharose（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）（2）离子交换剂的选择）离子交换剂的选择u强、弱离

43、子交换剂的选择：强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的强型：适用的pH范围广范围广弱型：适用的弱型：适用的pH范围窄范围窄u阴、阳离子交换剂的选择：阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性酶的稳定性若若pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）（3）平衡常数）平衡常数K（分配系数）（分配系数）组分离子在离子交换剂上的浓度（组分离子在离子交换剂上的浓度（mol/g）lK=组分离子在溶液中的浓度（组分离子在溶液中的浓度（mol/mL）l衡量离子交换剂的活性基团与组分离子的衡量

44、离子交换剂的活性基团与组分离子的亲和亲和力力lK值越值越大大，亲和力越，亲和力越大大，越易被离子交换剂吸附，越易被离子交换剂吸附，在体系内保留时间越在体系内保留时间越长长l根据根据K值之间的差异值之间的差异进行分离进行分离（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）3.操作操作平衡平衡上柱上柱（冲平）（冲平）去吸附去吸附分离结束分离结束再生再生+低低盐盐高高盐盐利用不同利用不同盐浓度将盐浓度将不同蛋白不同蛋白质质洗洗脱下来脱下来Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-

45、Cl-（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）4.应用应用：制备纯化生物大分子：制备纯化生物大分子5.影响离子交换层析的主要因素影响离子交换层析的主要因素lpHl离子强度：离子强度：分离样品需经脱盐处理分离样品需经脱盐处理l层析介质（流速、分辨率）层析介质（流速、分辨率）（二）离子交换层析（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）u又称又称疏水作用层析疏水作用层析u疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏

46、水性疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质质，根据被分离成分与固定相之间，根据被分离成分与固定相之间疏水力疏水力大小的不大小的不同而进行分离。同而进行分离。u从分离纯化的机制看，属从分离纯化的机制看，属吸附层析吸附层析类。类。（三）疏水层析（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography）u让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些蛋白质表面的一些疏水补丁疏水补丁，或让，或让蛋白质分子蛋白质分子内的疏水性残基内的疏水性残基暴露出来。暴露出来。u在在高盐浓度高盐浓度下，蛋白质发生局部结构可逆改变，

47、下，蛋白质发生局部结构可逆改变，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，通过被迫与疏水层析的固定相结合在一起，通过降降低流动相的离子强度低流动相的离子强度可将结合于固定相的蛋白可将结合于固定相的蛋白质，按结合力大小依次进行解吸附。质，按结合力大小依次进行解吸附。1.基本原理基本原理（三）疏水层析（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography）2.吸附剂：基质吸附剂：基质+配体配体亲水性（如亲水性（如Sepharose）u基质基质疏水性（如硅胶、树脂）疏水性（如硅胶、树脂）u配体配体（疏水性基团）（疏水性基团）：丁基、苯基、辛基、烷基：丁基、苯基、辛基、烷基（

48、三）疏水层析（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography）3.操作操作u加样加样：样品溶液中补加：样品溶液中补加适量的盐适量的盐。u洗脱洗脱：用：用降低盐浓度降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。的平衡缓冲液洗脱。u再生再生：除去固定相吸附的杂质：除去固定相吸附的杂质，用水或，用水或8mol/L脲素脲素溶液溶液。4.应用应用u主要用于分离纯化大分子物质（主要用于分离纯化大分子物质（与离子交换层析与离子交换层析互补互补）。）。（三）疏水层析（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography）与离子交换与离子交换层析比较？层析

49、比较？1.基本原理基本原理u利用固体吸附剂对不同组分间利用固体吸附剂对不同组分间吸附力吸附力（及洗脱液（及洗脱液对它的对它的解吸作用解吸作用）的差异进行分离。）的差异进行分离。（四）吸附层析（四）吸附层析（adsorptionchromatography）吸附作用的强弱主要与吸附作用的强弱主要与吸附剂吸附剂和和被吸附物质被吸附物质的性的性质有关。质有关。吸附层析的关键是吸附层析的关键是吸附剂吸附剂和和洗脱剂洗脱剂的选择。的选择。（四）吸附层析（四）吸附层析（adsorptionchromatography）2.吸附剂吸附剂根据吸附能力强弱分为：根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂弱吸附剂：蔗糖、淀粉

50、：蔗糖、淀粉中等吸附剂中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等强吸附剂强吸附剂：氧化铝、活性炭：氧化铝、活性炭根据材料分为：根据材料分为：无机吸附剂无机吸附剂/有机吸附剂有机吸附剂（四）吸附层析（四）吸附层析（adsorptionchromatography）3.洗脱剂洗脱剂l极性组分：极性洗脱剂极性组分：极性洗脱剂l非极性组分：非极性洗脱剂非极性组分：非极性洗脱剂l注意：纯度高、稳定性好、溶解度大、流动性好注意：纯度高、稳定性好、溶解度大、流动性好4.洗脱方法洗脱方法l溶剂洗脱法溶剂洗脱法：单一：单一/混合溶剂洗脱混合溶剂洗脱l置换洗脱法置换洗脱法：置换剂取代洗脱：置换剂取