(4.12)--第四章酶的分离纯化.ppt

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1、Chapter 4 The Extraction,Separation and Purification of Enzyme酶的分离纯化酶的分离纯化Contents of chapter 41、酶的提取与分离纯化技术路线2、预处理与细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法5、酶的组合分离纯化策略6、酶的浓缩、干燥与结晶4.1 概述：酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液初步：离心分离，过滤分离，沉淀分离，初步：离心分离，过滤分离，沉淀分离，萃取分离萃取分离高度：离交、亲和、疏水、吸附

2、、电泳高度：离交、亲和、疏水、吸附、电泳无菌过滤、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶常用的酶提纯方法常用的酶提纯方法性质方法溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、溶剂萃取电荷离子交换层析、电泳等电点色谱聚焦、等电聚焦分子大小离心分离、凝胶过滤、透析超滤生物亲和性亲和层析、免疫吸附层析、亲和萃取酶的纯化过程，约可分为酶的纯化过程，约可分为三个阶段：三个阶段：(1)粗蛋白质粗蛋白质(crude protein):采样采样 均质打破均质打破细胞细胞 抽出全蛋白，多使抽出全蛋白，多使用用 盐析沉淀法盐析沉淀法；可以粗略；可以粗略去除蛋白质以外的物质。去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化部分纯化(partiall

3、y purified):初步的纯化，使初步的纯化，使用各种用各种柱层析法柱层析法。(3)均质酶均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，目标酶的进一步精制纯化，可用可用制备式电泳制备式电泳 或或 HPLC。酶分离纯化不同阶段4.2 预处理与细胞破碎q 去除发酵液中部分杂质。1.大多数酶都采用微生物细胞进行发酵生产。从微大多数酶都采用微生物细胞进行发酵生产。从微生物发酵液中提取酶的第一个必要步骤就是发酵生物发酵液中提取酶的第一个必要步骤就是发酵液的预处理。预处理的目的：液的预处理。预处理的目的：q 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度；q 尽可能使产物转入便于后处

4、理的某一相中(多数是液相)；v发酵液的相对纯化(1)无机离子的去除(影响树脂的交换容量)发酵液中的无机离子主要有：Ca2+、Mg2+和Fe2+等。除去Ca2+，常用草酸；除去Mg2+，可加入三聚磷酸钠形成可溶性络合物；除去Fe2+，可加入黄血盐（亚铁氰化盐）,使其形成沉淀。2.预处理过程预处理过程v发酵液的固液分离固液分离的主要方法是离心分离和过滤。微生物酶发酵液的固液分离，国内外常采用的设备是转鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机。(3)色素及其他物质的去除常用的脱色剂有活性炭、离子交换树脂、离子交换纤维。(2)杂蛋白质的去除(影响树脂的交换容量，提取时容易产生乳化)1)沉淀法2)变性

5、法3)凝聚和絮凝4)吸附法4.2 预处理与细胞破碎酶酶来源来源应用应用青霉素酰化酶大肠杆菌(Escherichia coli)青霉素的脱酰作用蔗糖酶啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)糖果、蜜饯葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Saccharomyces cerevisiae临床分析胆固醇氧化酶紫红诺卡氏菌(Nocardia rhodochrous)胆固醇浆液分析过氧化氢酶黑曲霉(Aspergillus niger)牛奶灭菌后H2O2的清除1.大部分酶都存在于细胞内。下表为部分微生物胞内酶：1、细胞破碎、细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这

6、些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎高高压压细细胞胞破破碎碎机机参见动画超超声声波波细细胞胞粉粉碎碎机机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏

7、，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理包含体包含体l大肠杆菌表达系统表达的异体蛋白可占菌体总蛋白的1050，这样的高产量使某些目的蛋白质以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物，这就是包含体，或者叫包涵体。二、包含体的处理l分离的一般步骤l细胞破碎l包含体的分离、洗涤l溶解包含体l变性蛋白质的纯化l目的产物的复性与分离l复性方法：透析

8、或超滤l复性率低：20Dialysis(透析透析)l酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。l酶提取时首先应根据酶酶的的结结构构和和溶溶解解性性质质，选选择择适适当当的的溶溶剂剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。l酶都能溶解于水，通常可用水水或或稀稀酸酸、稀稀碱碱、稀稀盐盐溶溶液液等等进进行行提提取取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。4.3 酶的提取酶的提取提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离

9、，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取 0.020.5 mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取 pH 26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取 pH 812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶盐溶现象盐溶现象大多数蛋白类酶都溶于

10、水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象盐溶现象。分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。4.4 酶的分离方法酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离5、电泳分离6、萃取分离1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解溶解度降低度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉

11、淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象盐析现象。盐析现象盐析现象蛋白

12、质分子表面的疏水性区域会聚集许多水分子，当盐类加入时，这些水分子被抽出，促使暴露出來的疏水性区域互相结合，形成沉淀。常用的盐析方法常用的盐析方法 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度饱和度表示。降低水活性，使溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间的作用力，因而聚集在一起。有

13、机溶剂沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶溶液液的的介介电电常常数数降降低低，就就使使溶溶质质分分子子间间的的静静电电引引力力增增大大，互互相相吸吸引引而而易易于于凝凝集集，同同时时，对对于于具具有有水水膜膜的的分分子子来来说说，有有机机溶溶剂剂与与水水互互相相作作用用，使使溶溶质质分分子子表表面面的的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常常用用于于酶酶的的沉沉淀淀分分离离的的有有机机溶溶剂剂有有乙乙醇醇、丙丙酮酮、异异丙丙醇、甲

14、醇等醇、甲醇等。2、离心分离、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常常速速离离心心机机又又称称为为低低速速离离心心机机,其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。高高速速离离心心机机的最大转速为（12.5）104 r/min，相对离心力达到 11041105 g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞

15、碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有有些些高高速速离离心心机机装设有冷冻装置装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。谓之高速冷冻离心机。超超速速离离心心机机的最大转速达(2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。参见动画一般的重力离心只把颗粒与溶液分开样本：多为蛋白质密度相似、分子量不同样本：多为核酸密度不同、分子量相似区带离心等密度离心不同离心方法的对比不同离心方法的对比超速离心机按照其用途可以分为

16、制备用制备用超速离心机超速离心机、分析用超速离心机分析用超速离心机和分析分析-制备两用超速离心机制备两用超速离心机3种 蛋蛋白白质质分分子子在在离离心心时时，其其分分子子量量、分分子子密密度度、组组成成、形形状状等等，均均会会影影响响其其沉沉降降速速率率，沉沉降降系系数数即即用用來來描描述述此此沉沉降降性性质质；其其单位为单位为 S(Svedberg unit)。两种超速离心方法的对比两种超速离心方法的对比离心方法离心方法区带离心区带离心等密度离心等密度离心梯度形成方式预备梯度（蔗糖、甘油）离心时自动形成（CsCl）梯度较浅，密度较低梯度陡峭，密度较高通用样本性质密度相近，分子量不同分子量接近

17、或密度不同蛋白质核酸、细胞器官离心情形速度较低，不完全沉降，要在适当时间停止离心完全沉降至与样本密度相同的梯度位置，需高速，长时间3、过滤与膜分离、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤非膜过滤：采用高分子膜非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质子膜为过滤介质 过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)

18、类别类别截留颗粒大小截留颗粒大小截留的主要物质截留的主要物质过滤介质过滤介质粗滤粗滤 2 m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤微滤0.22 m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤超滤20 0.2 m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透反渗透20 (40,000)压力差，100kPa 筛分 超滤UF 120(10,000-40,000)压力差，100kPa 筛分 纳滤NF 1 (1001000)压力差，100)压力差，1000kPa 优先吸附、溶解扩散 四种常用膜分离技术的基本特征四种常用膜分离技术的基本特征 四种常用四种常用膜分离过程膜分离过程的截留特性的截

19、留特性其演化史其演化史Martin,Synge(1952)4、层析分离、层析分离 Chromatography层析层析分析法的基本分析法的基本机制：相似相溶机制：相似相溶极性相似的两分子间，其亲和力较强。LikeLikeDissolvesDissolvesLikeLike层析分离层析分离 的基本原理的基本原理层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的个相中，其中一个相为固定的(称为固定相称为固定相)，另一个相则流过此固定，另一个相

20、则流过此固定相相(称为流动相称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。观看动画-层析法层析分离方法层析分离方法层析方法层析方法分离依据分离依据吸附层析吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析分配层析利用各组分在两相中的分配系数分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力亲和力不同而达到分离目的凝胶层析凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专

21、一而又可逆的专一而又可逆的亲和力亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离1.吸附层析吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸吸附层析柱附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过吸、吸附、再解吸、再吸附的

22、过程。程。溶剂洗脱法/置换洗脱法/前缘洗脱法 2.分配层析分配层析分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。纸上层析纸上层析分配薄层层析分配薄层层析 参见动画薄

23、层板Thin-layer plate点样Sample spotting展开剂Add developer展开 Developing薄层层析法操作 Thin-layer chromatographyActivatedActivatedNot-activatedNot-activated3.离子交换层析离子交换层析 Ion-exchange Chromatography 离子交换层析是利用离子交换层析是利用离子交换剂离子交换剂上的可解离基团对各种上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离的方法。离子的亲和力不同，而使不同物质分离的方法。离子交换剂：是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。离

24、子交换剂：是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。它是通过在不溶性高分子物质它是通过在不溶性高分子物质(母体母体)上引入若干可解离上引入若干可解离基团基团(活性基团活性基团)而制成。而制成。分类：离子交换剂分类：离子交换剂活性基团母体阳离子交换剂阴离子交换剂离子交换树脂离子交换纤维素离子交换凝胶参见动画阴离阴离子交子交换树换树脂脂(Anion exchange)阳离子阳离子交交换树换树脂脂(Cation exchange)离子交换层析离子交换层析 Ion-exchange Chromatography l离子交换层析的原理离子交换层析的依据就是物质所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对柱中的离子

25、交换剂有不同的亲和力，改变洗脱液的离子强度和pH，物质就能依次从层析柱中分离出来。例如当溶液的pH值低于酶蛋白的等电点时，它们带正电荷，可结合到阳离子交换树脂上，随着pH值逐渐升高，它们将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被依次洗脱出来。l离子交换剂的构成 离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。如羧 甲基纤维素离子交换剂组成示意图为：O纤维素CH2COO_Na+基质基质电荷基团电荷基团反离子反离子l 离子交换剂的选择：离子交换剂的选择：阴阳离子交换剂的选择 强、弱离子交换剂的选择 不同离子型交换剂的选择 不同基质离子交换剂的选择l 离子交换剂的处理：离子交换剂的处理：浸泡 清洗 酸碱洗 转

26、型l电荷高 l离子体积大 l浓度高 离子取代的优先顺序：离子取代的优先顺序：+又称为凝胶过滤凝胶过滤，分子排阻层析分子排阻层析，分子筛层析分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。4.凝胶层析参见动画大大分分子子移移动动较较快快先先流流出出常用的凝胶：葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（Sephadex G系列产品：系列产品：G后面的阿拉伯数字越大，表示交后面的阿拉伯数字越大，表示交联度越小、凝胶孔径越大、分离范围越大。）联度越小、凝胶孔径越大、分离范围越大。）琼脂凝胶与琼脂糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 凝胶

27、的结构Even stronger backboneMuch bigger space 琼脂凝胶琼脂凝胶的成的成胶胶反反应应 Agar gel formation管柱內凝胶的组成间隔 Spaces in a columnAdapted from Pharmacia(1991)Gil Filtration Principles and Methods p.11VtVoVt-Vo管柱总体积凝胶外体积胶体內体积Mobile phaseStationary phase介质的粗细影响解析力分离效果差色谱峰太平最佳分离效果0501000.51.01.5SuperfineFineCoarseVe/Vt0501

28、00050100Relative amountAdapted from Pharmacia:Gil Filtration Principles and MethodsBead size is critical to the resolution of gel chromatography粒子粗细影响溶液流动 Bead size vs flow rate凝胶的颗粒越小 其解析力越大 但流速变慢Adapted from Scope RK(1987)Protein Purification Principles and Practice p.192Smaller particles also red

29、uce the space between the beads,and prevent the turbulence as the buffer flows,but the flow rate might be decreased色谱管柱的形状10 cm230 cm10 cm30 cm2300 cm3矮胖型Short and fat细长型Long and slim 矮胖型管柱分离效果不佳Fat column cannot tolerate poor separation 但其流速及容量均较大But it has better flow rate and higher capacityAdapt

30、ed from Scope RK(1987)Protein Purification Principles and Practice p.195液相层析管柱系统缓冲液Buffer梯度制造器Gradient mixer泵 Pump记录器Recorder监视器Monitor管柱Column凝胶Gel凝胶装填分批收集器Fraction collector(1)(2)(3)(4)(5)adapterreservoir转接器ConnectorThe whole family of liquid chromatography apparatusJuang RH(2007)EPAl凝胶柱装填方法 Packi

31、ng column step by step缓冲液平衡Equilibratedin buffer温度平衡Temperatureequilibrated静置凝胶Gel stands o/n清洗凝胶Wash gel well预估体积Estimate gel volume装填凝胶Pouring gelsmoothly暂停流洗Stop elutionX继续流洗Keep elutingPut on reservoir已堆积Sediment沉积中In progressing上清Supernatant加压流洗Elute underHigh pressurePut on adaptor紧密堆积检查管柱是否畅通12GelGelCheck flow rate of empty column Juang RH(2007)EPAGel should be packed tightly一口气倒入凝胶，勿掺入气泡。Pour gel slurry smoothly(non-stop),avoid trapping any bubble