琼脂扩散实验ppt.pptx

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1、琼脂扩散实验 鸡鸡马马立立克克氏氏病病就就是是由由鸡鸡 马马 立立 克克 氏氏 病病 病病 毒毒(M MD DV V)引引 起起 得得 鸡鸡 得得 一一 种种肿肿瘤瘤性性传传染染病病。临临床床上上以以消消瘦瘦、麻麻痹痹、皮皮肤肤与与内内脏脏出出现现肿肿瘤瘤为为主主要要特特征征。可可造造成成严严重重得得经经济济损损失失,就就是是世世 界界 养养 鸡鸡 业业 得得 主主 要要 疾疾病之一。病之一。鸡马立克氏病引起的劈叉姿势 流行病学 临床症状 病理组织学检查 病毒分离鉴定 血清学试验:琼脂扩散实验(OIE推荐得替代试验方法)马立克氏病诊断主要根据马立克氏病诊断主要根据 酶联免疫吸附实验AGP可用于

2、20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测与1月龄以上鸡血清抗体检测。目得要求 了解琼脂扩散试验进行疾病诊断得操作与结果判定方法 仪器与材料 器材:琼脂打孔器、微量移液器或带胶乳头滴管、平皿等。试剂:马立克氏病标准抗原、标准阳性血清与标准阴性血清。实验类型 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散双向双扩散 实验目得要求、类型、仪器与材料实验目得要求、类型、仪器与材料 利用可溶性抗原与抗体在半固体凝胶中进行相向扩散反应,当抗原抗体分子相遇并达到适当比例时,就会互相结合、凝集,在两孔之间比例最合适得位置上出现白色沉淀带,从而判定相应得抗体与抗原。可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测与1月龄

3、以上鸡血清抗体检测。实验原理实验原理 实验原理实验原理 A.琼脂糖得疏散网状结构有利于大分子得自由迁移;B.合适比例得抗原抗体结合后聚集形成沉淀;C.沉淀得产生阻止抗原抗体复合物得自由运动;D.沉淀带一经形成,就像一道特异性得屏障一样,继续扩散而来得相同得抗原抗体,只能就是沉淀带加浓加厚,而不能再向外扩散,但对其她抗原抗体系统则无屏障作用。沉淀线得特征与位置:1 抗原、抗体得特异性与浓度 2 抗原、抗体分子得大小 3 扩散率 实验原理实验原理 a、如抗原抗体得浓度基本平衡时,此沉淀带得位置主要决定 于两者得扩散系数。b、如果抗原过多,则沉淀带向抗体偏移,反之亦然。实验原理实验原理 实验原理实验

4、原理 抗原分子量抗原分子量 抗体分子量抗体分子量抗原分子量抗原分子量=抗体分子量抗体分子量抗原分子量抗原分子量 抗体分子量抗体分子量c、1%琼脂粉琼脂粉 0 0、01M PBS 01M PBS 封底封底 1万硫柳汞万硫柳汞水浴加热融化水浴加热融化实验步骤实验步骤琼脂平板制备琼脂平板制备 鸡群马立克氏病感染情况得监测通常采用琼脂扩散试验,检测对象包括:血清中马立克氏病病毒特异抗体或感染鸡羽髓中马立克氏病病毒抗原。其操作方法如下:1、琼脂糖平板制备 用0、01M pH7、4得PBS配制1琼脂糖溶液,水浴加温充分溶化后,加入培养皿,制成厚度约23mm厚得琼脂糖凝胶板;置于室温下冷却凝固后,用7孔(梅

5、花孔)打孔器准确打孔,加热封底。实验步骤实验步骤 12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流2、检测血清抗体时,中央孔内滴加马立克氏病病毒标准琼扩抗原,周边孔滴加待检血清,但至少一孔加阳性血清,抗原与血清得加入量以加满而不溢出为度。样品加毕后,将琼脂平皿加盖后平放于加盖得湿盒内,37温箱中孵育824h,观察并记录结果。测定抗体效价时可倍比稀释血清,以出现沉淀带得血清最大稀释度为抗体效价。实验步骤实验步骤 3、检测抗原时,中央孔加马立克氏病标准阳性血清,周边1、4孔加马立克氏病标准琼扩抗原,周边

6、2、3、5、6孔加待检羽髓浸液,即在试管内加入12滴PBS然后将羽髓在其中挤压而成。加样后将琼脂平皿置湿盒内,于37温箱孵育,824h内观察结果。实验步骤实验步骤 1、切勿剧烈振荡融化后得琼脂糖,防止气泡得出现。2、反应时间要适宜,时间过长,沉淀线可解离而导致假 阴性、不出现或不清楚。3、加样时,注意不要产生气泡,以加满为度。4、每加完不同得样后要更换枪头,以免造成污染。注意事项注意事项 实验步骤实验步骤抗原检测抗原检测Ab+Ag+32Ag+65检测羽髓抗原检测羽髓抗原2,3,5,6孔分别孔分别加入倍比稀释得待检羽髓浸液加入倍比稀释得待检羽髓浸液Ag+432165检测待检血清检测待检血清15孔

7、分别加入倍比稀释得待测效孔分别加入倍比稀释得待测效价得血清价得血清,6孔加孔加PBS抗体检测抗体检测 当被检样品孔与中心孔之间形成清晰得沉淀线,并与周边已知抗原孔得沉淀线互相融合时判为阳性;不出现沉淀线者判为阴性 结果判定结果判定 已知抗原与阳性血清之间所产生得沉淀线末端弯向被检样品孔内侧时,则该被检样品判为弱阳性。结果判定结果判定 Ag+Ag+Ab+待检血清 被检材料可能出现两条以上沉淀线,其中一条与已知抗原与阳性血清得沉淀线融合者判为阳性。当抗原存在多种成分时,将呈现多条沉淀线以至交叉反应线,因此可用来检查抗原与免疫血清得特异性、纯度或浓度,比较抗原之间得异同点,因而应用范围较广。标准琼扩抗原标准琼扩抗原待检羽髓浸液待检羽髓浸液 结果判定结果判定