(9)--11.4线粒体疾病的分子生物学检验.ppt

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1、线粒体（Mitochondrion）1.真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢2.多数细胞含几个到几千个线粒体3.每个线粒体含2-10 线粒体DNA（mtDNA）线粒体功能Mitochondrial Disease.Chest 2001;120:634648 ATP“细胞的能量工厂”一、线粒体基因组（mitochondrial DNA，mtDNA）（一）基因组概况 1.结构基因 2.tRNA基因 3.rRNA基因 4.非编码区线粒体基因组（mitochondrial DNA，mtDNA）（二）线粒体DNA与核DNA的关系1、转录因子（Transcription factor）是连接两者之间

2、的分子基础2、核呼吸因子可以同时作用于nDNA和mtDNA，通过调节呼吸链亚基的合成来影响细胞的呼吸3、mtDNA基因的表达受到nDNA的制约，线粒体功能变化也会对nDNA的复制与转录有调控作用4、mtDNA与nDNA之间的相互协调，才使线粒体蛋白生物合成得以发生二、线粒体病（Mitochondrial disorders）发现-1962 年，Lufe 等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年，Wallace 等报道了首例由线粒体 DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA 突变可引起人类疾病。定义-是遗传缺陷引起线粒体异

3、常，致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。发病率-约为1:5000（约每5000人中1人发病）线粒体病（Mitochondrial disorders）（一）线粒体疾病的遗传特点：母系遗传规律同质性突变与异质性突变线粒体基因q 同质性（Homoplasmy）q 0 或 100%q 异质性（Heteroplasmy）q 0-100%核基因q 纯合子（Homozygous）q 0 或 100%q 杂合子（Heterozygous）q 50%mtDNA同质性/异质性突变与阈值线粒体疾病是复杂性疾病遗传方式复杂常染色体隐性遗传（Autosomal Recessiv

4、e）常染色体显性遗传（Autosomal Dominant）性连锁遗传（Sex linked）母系遗传（Maternally inherited）临床表型复杂累及多系统（Multisystemic involvement）影响几乎所有组织器官（Any organ or tissue can be affected）线粒体功能涉及众多的组织器官线粒体病的共同临床特点l 婴儿期发病：常见于婴儿伴随COX 阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。l 儿童发病：见于MELAS、MERRF、Leigh 病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。l 中枢神经系统损害：共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等l 周围神

5、经损害：交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征l 视听神经损害：视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型 听力丧失出现在KSSl 肌肉病 见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO（高度临床变异性）Chinnery et al.Lancet 2000常见的线粒体疾病1阿兹海默病 2糖尿病3Leber 氏遗传性视神经病变 4、遗传性耳聋 5、MELAS综合征6、癫痫 阿兹海默病（Alzheimers disease，AD）俗称老年痴呆，是一种神经退行性疾病，高发人群为65岁以上的老年人。研究发现，线粒体DNA功能异常是导致该病的主要原因，通过聚合酶链式反

6、应（PCR）与印迹杂交（Southern blot）检测发现，散发型AD患者脑组织mtDNA存在断裂、碱基缺失、错义突变等情况，而且在电镜下观察发现线粒体数目增加。溶酶体功能减弱，也导致线粒体自噬功能降低，活性氧增多以及多种酶活性降低，造成氧化过激以及代谢损伤。-淀粉样蛋白损害葡萄糖等营养物质的传送，使突触末端线粒体功能失常，导致患者认知能力下降。此外mtDNA的缺失还导致神经细胞中钙离子稳态被破坏，线粒体摄取多余钙离子，最终诱导线粒体凋亡。由此可见，阿兹海默病与线粒体的功能息息相关。糖尿病（diabetes mellitus DM）线粒体基因突变导致的糖尿病在成人糖尿病患者以及儿童糖尿病患者

7、中都很常见。91%青少年线粒体糖尿病患者突变位于线粒体氧化呼吸链和基因。线粒体全基因组测序表明患者共有33个变异位点，但只有A3243G突变是进化上高度保守的位点，是与糖尿病家系发病唯一有关的mtDNA 突变，该突变点位于16S rRNA与tRNA交界处，改变了tRNALEU(UUR)双氢尿苷环，引起线粒体末端转录损害，从而使线粒体蛋白质合成异常和功能缺陷，影响呼吸链的组分与功能而致胰岛细胞葡萄糖氧化磷酸化障碍，ATP产生不足，导致胰岛素分泌障碍，引发糖尿病。Leber 氏遗传性视神经病变 Leber氏遗传性视神经病变（Lebers hereditary optic neuropathy，LH

8、ON）是第一个被鉴定出与mtDNA点突变有关的母系遗传疾病，1871年，德国眼科医生Leber首先报道了该病的临床特征。到目前为止，已经报道的与该病有关的mtDNA突变位点有60多个，这些突变包括原发性与继发性，而90-95%的患者只携带该病3个mtDNA原发突变（图12-3）图12-3 mtDNA 11778位点GA的突变遗传性耳聋 线粒体基因突变主要导致遗传性耳聋，研究发现，无论在耳蜗外毛细胞还是支持细胞等组织中都含有丰富的线粒体，线粒体的结构与功能对维持听觉具有重要的作用。位于mtDNA 12S rRNA上的A1555G、C1494T突变是人们最早发现的与遗传性耳聋有关的线粒体突变位点，

9、12S rRNA上的A827G通过影响线粒体12S核糖体RNA的空间结构来影响患者听力。tRNASer(UCN)T7511C等突变与非综合征型耳聋有关，tRNALeu(UUR)A3243G突变可导致综合型耳聋。目前有关线粒体tRNASer(UCN)突变与耳聋发病机制的研究是当前线粒体tRNA众多突变中研究最多也是最明确的。MELAS综合征 线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作（mi-tochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS）综合征是一种以脑卒中样发作为主要特征的线粒体脑肌病

10、，多为母系遗传，也有散发病例。该综合征多由 tRNAleu、tRNAPhe、tRNAVal、tRNALys、COX、ND1、ND5、rRNA等基因的点突变或是细胞色素b基因的小范围缺失而引发，突变多表现为异质性。其中80%的MELAS综合征患者为tRNAleu(UUR)基因的A3243G点突变（图12-4）图12-4 A3243G突变体结构癫痫（epilepsy）癫痫是最常见的神经系统疾病之一。在线粒体疾病患者中，癫痫的发病率和患病率都极高。据文献报道成人线粒体病患者癫痫发生率约为 23.1%，其中 A3243G 突变的线粒体病患者中，癫痫的发生率为 34.9%，而 A8344G 突变的患者癫

11、痫发生率更是高达 92.3%。线粒体疾病典型症状之一是血液中堆积乳酸导致酸中毒。乳酸中毒伴卒中样发作（MELAS 综合征）是癫痫中的一种，与MELAS综合征相关的mtDNA点突变超过了 20 种。此外，已经发现肌阵挛性癫痫与破损性红肌纤维病（MERRF）的发病个体为 mtDNA 异质性，发病程度与mtDNA突变量相关联。三、线粒体疾病的基因诊断1.mtDNA碱基位点 2.mtDNA缺失或插入片段 3.mtDNA拷贝数三、线粒体疾病的基因诊断1.mtDNA碱基位点 mtDNA的碱基突变是最常见的线粒体DNA突变，主要为2/3的点突变发生于编码tRNA、rRNA的基因，1/3的点突变发生于编码mR

12、NA的基因。目前已报道的mtDNA点突变超过330种，其中结构基因突变177种，tRNA基因突变137种，rRNA基因突变12种，DLoop区突变2种。mtDNA与nDNA一样，基因的点突变包括移码突变以及碱基置换突变，碱基置换又会导致同义突变、错义突变和无义突变。碱基置换中的错义突变往往导致氨基酸的改变，从而改变合成的蛋白质的结构以及功能发生改变。三、线粒体疾病的基因诊断2mtDNA缺失或插入片段 大片段的缺失往往涉及多个基因，可以导致线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）功能下降，产生ATP减少，从而影响组织器官的生理功能。根据病理分类主要有两类缺失，单个缺失与多重缺失。单个缺失的分子数量占总m

13、tDNA的20-80%，常见于慢性进行性外眼肌麻痹（COEP），Kearns Sayre综合征（KSS）及Pearsons综合征。多重缺失常见于组织正常的衰老过程，如骨骼肌、心肌及脑。一些非致命性呼吸衰竭、肝功能衰竭、肾功能衰竭以及乳酸酸中毒病人的组织细胞中常见线粒体DNA丢失，造成线粒体形态学改变、细胞生长抑制。mtDNA的插入突变比较少见。三、线粒体疾病的基因诊断3mtDNA拷贝数 真核生物中每个细胞有几百至几千个甚至上万个线粒体，细胞内线粒体的数量反映了细胞对能量的需求程度，每个线粒体内有2-10个mtDNA拷贝。所谓mtDNA拷贝数（copy number）就是指线粒体内mtDNA拷贝

14、的绝对数量。mtDNA拷贝数与线粒体表达系统的效率相关，拷贝数增加可认为是总线粒体呼吸功能的代偿。当mtDNA拷贝数减少时可导致细胞缺乏能量而功能下降，并由此引发疾病。近年来的研究表明，在胃癌、食管鳞状细胞癌等许多肿瘤细胞的线粒体内mtDNA拷贝数减少，提示mtDNA拷贝数有望成为一种新的肿瘤分子标志物。（表12-2）线粒体疾病的分子诊断检验方法1.PCR-DHPLC 聚合酶链反应-变性高效液相色谱（polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography，PCR-DHPLC），这一技术最先由美国St

15、anford大学 Oefner于1995年建立，它通过一个独特的DNA色谱柱-DNA Sep柱，进行核酸片段的分离和分析。PCR-DHPLC的原理:（1）在不变性的温度情况下，检测并分离分子量不同的DNA双链或分析有一定 长度的核苷酸片段，类似RFLP分析；（2）在充分变性的温度情况下，可以区分单链DNA与RNA分子，适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制；（3）在部分变性的温度条件下，PCR产物加热到95，突变型DNA与野生型DNA发生变性分离，在温度下降时，PCR复性产物形成杂合子与纯合子的混合物。线粒体疾病的分子诊断检验方法2.PCR-RFLP 限制性片段长度多态性聚合酶链反应（res

16、triction fragment length polymorphism，RFLP，PCR-RFLP）技术，又称为CAPs技术。它的基本原理是用PCR来扩增目的DNA，特定的限制性核酸内切酶具有识别并剪切特定的DNA序列位点的能力，扩增产物用特异性内切酶消化切割成不同长度的DNA片段条带，通过琼脂糖凝胶电泳可反映DNA特定区域的结构改变（如图12-5）。图12-5 野生型与突变型的琼脂糖电泳线粒体疾病的分子诊断检验方法3.DNA芯片技术 DNA芯片技术是基于核酸互补杂交原理研制的DNA微阵列，即在固相载体上制备成千上万的呈网络状密集排列的基因探针，待分析的样品通过与芯片中已知碱基序列的DNA

17、片段互补杂交，从而确定样品中的核酸序列和性质，对基因表达量和特性进行分析。当溶液中带有荧光标记的核酸序列时，与基因芯片上对应位置的核酸探针完全互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。DNA芯片技术是二十世纪九十年代初期发展起来的由分子生物学、微电子学、物理学、化学和计算机学等多学科交叉融合而成的技术。线粒体疾病的分子诊断检验方法4.DNA测序技术 二十世纪七十年代中期，Sanger等提出了的“DNA双脱氧链末端终止测序”，又称Sanger测序。同时，GIBERT 等提出“DNA化学降解测序”。后续又出现了基因芯片测序技术、PCR直接测序技术、cDNA微阵列技

18、术。以及国际最新的DNA测序技术Solexa技术。线粒体疾病的分子诊断检验方法在上述介绍的方法当中1、PCR-RFLP检测成本低廉，设备简单，技术要领不高，适合做为初筛的方法。2、PCR-DHPLC灵敏度较高，是高通量筛选DNA序列变异的最新技术，但是该技术所需设备价格昂贵限制了此方法的应用。3、DNA测序技术是检测DNA基因突变的金标准。若突变位点未知，可以通过DNA芯片技术、全基因组测序技术查找到突变位点，虽然这些技术通量高，准确度高，但是成本高昂，不利于推广。四、线粒体病分子生物学检验的应用1.mtDNA与遗传性耳聋 2.mtDNA与Leber遗传性视神经病变 3.mtDNA与MELAS

19、综合征4.mtDNA与糖尿病 四、线粒体病分子生物学检验的应用1mtDNA与遗传性耳聋 线粒体12S rRNA基因的A1555G和C1494T突变是导致氨基糖苷类抗生素耳毒性聋的主要分子致病基础：tRNASer（UCN）T7511C等突变则与非综合征型耳聋有关；而tRNALeu(UUR)A3243G等突变可导致综合征型耳聋（图12-6）。对耳聋相关mtDNA突变的检测常采用PCR-RFLP技术。是用特定的限制性内切酶水解目标基因的 PCR 扩增产物，目前常用的有Alw26、Apa和Xba等来检测mtDNA A1555G、A3243G和A7445G等突变。然后分析酶解产物的电泳图谱特征，根据与正

20、常对照的比对结果来判断待检样品是否存在某个基因突变，其弱点是操作繁琐和检出率低，因为并非所有的基因突变都能恰好被某个内切酶所识别。四、线粒体病分子生物学检验的应用图12-6 遗传性耳聋的PCR-RFLP检测四、线粒体病分子生物学检验的应用2mtDNA与Leber遗传性视神经病变 Leber遗传性视神经病变（LHON）是第一个被鉴定出来的与mtDNA突变有关的母系遗传疾病。主要累及的病变有视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，最终导致视神经变性。LHON发病的分子基础是mtDNA突变（图12-7）。突变主要有原发性和继发性两种，其中ND1 G3460A、ND4 G11778A和ND6 T1448

21、4C这三个突变位点是最主要的原发突变，继发突变往往与原发突变协同作用而影响LHON的发病。四、线粒体病分子生物学检验的应用图12-7 LHON突变位点四、线粒体病分子生物学检验的应用 目前，国内的实验室较多采用合适的限制性核酸内切酶如 BsaH、Mae 及Mva 等来检测mtDNA ND1 G3460A、ND4 G11778A和ND6 T14484C等突变。这三种限制性核酸内切酶特异地识别所扩增的亚单位片段上特定的碱基序列（图12-8）。若没有发生突变，则限制性核酸内切酶可以识别基因中原有序列，故限制性核酸内切酶可以将PCR产物消化成两个片段；若发生了突变，则原有的限制性核酸内切酶所识别的碱基

22、序列不存在，PCR产物就无法被上述限制性核酸内切酶所消化。图12-8 A3243G突变测序图四、线粒体病分子生物学检验的应用3mtDNA与MELAS综合征 MELAS 综合征病情复杂多变，由于其临床表现的非特异性，误诊率较高，已受到多学科临床医生的广泛关注。主要累及tRNALeu(UUR)、tRNAPhe、tRNAVal、tRNATrp、tRNALys、tRNALeu(CUN)、16rRNA、ND1、ND5和ND6等基因。由于80%的患者为tRNA leu(UUR）基因的A3243G点突变，因此常以A3243G点突变作为研究对象，揭示MELAS综合征的发病机制。实验验室采用PCR-DHPLC技

23、术，提取外周血或肌肉组织DNA作为模板，用PCR进行测定。引物序列为：正向（F）:5-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3：反向（R）:5-GCGATGGTGAGAGAGCTAAGGTC-3：扩增线粒体靶DNA片段（3153-3551bp）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物经变性复性后进行DHPLC分析。一般情况下，色谱峰双峰为杂合子，单峰为纯合子。四、线粒体病分子生物学检验的应用4mtDNA与糖尿病 线粒体基因突变糖尿病是糖尿病的一种特殊类型，是因线粒体基因突变所引起的非胰岛素依赖性糖尿病，属于细胞遗传缺陷疾病。1999年，WHO把糖尿病分为4种类型，将线粒体糖尿病列为特殊

24、糖尿病的一种，虽然目前已发现约有几十种线粒体基因突变与糖尿病有关，但tRNAleu(UUR)A3243G突变是目前国际上唯一公认的线粒体糖尿病致病突变。许多分子检验技术同样可以用于检测线粒体糖尿病，如PCR-DHPLC、PCR-RFLP、DNA测序、基因芯片等。四、线粒体病分子生物学检验的应用图12-9 含mtDNA 3243 PCR产物的限制性内切酶（Apal）酶切结果图 采用PCR-RFLP技术检测时：由于该突变为异质性突变，限制性内切酶Apal（酶切位点GGGCCC）酶切时会出现三条带（图12-9），分别为553bp、423bp、130bp共三条条带；由于野生型mtDNA无Apa酶切位点，所以电泳条带上只能看到553bp的一条片段。