(12)--第九章分子生物学检验新技术.ppt

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1、在SDS-P A GE 中，当蛋白质或者亚基的分子量在什么范围内，电泳迁移率与分子量的对数成线性关系15KD1015KD15200KD300500KDABCD提交单选题1 分D T T 可以断开蛋白质分子间氨基酸残基形成的氢键离子键二硫键疏水键ABCD提交单选题1 分SDS-P A GE 电泳消除或者掩盖了不同种类蛋白间的分子大小差异电荷差异疏水性差异离子键差异ABCD提交单选题1 分凝胶上蛋白质的检测方法有考马斯亮蓝染色银染荧光染色同位素染色ABCD提交多选题1 分目前灵敏度最高的蛋白染色方法是考马斯亮蓝染色银染荧光染色同位素染色ABCD提交单选题1 分雪崩效应会出现在哪一种蛋白染色方法中考

2、马斯亮蓝染色银染荧光染色同位素染色ABCD提交单选题1 分双向凝胶电泳是利用蛋白质的什么差异区分不同蛋白质电荷数量分子量大小氨基酸种类蛋白亚基种类ABCD提交多选题1 分双向凝胶电泳的第一向电泳的说法正确的是第一向是等电点电泳不能改变蛋白质的等电点、导电性能需要将蛋白变性需要加入SDS 变性剂ABCD提交多选题1 分蛋白质芯片中将已知蛋白质或多肽固定在固相载体后，可以根据哪些生物分子特性识别待检测蛋白或者多肽抗原-抗体受体-配体酶-受体DNA-DNA 二聚化ABCD提交多选题1 分不依赖凝胶蛋白电泳的蛋白质组学分析方法有：生物质谱分析技术蛋白质多维液相分离技术琼脂糖凝胶电泳二代测序ABCD提交

3、多选题1 分第九章 分子生物学检验新技术检验医学院陈林洁 蛋白质组学 内容第一节 数字PCR技术一、数字PCR技术发展历史二、数字PCR技术的原理三、数字PCR技术分类四、数字PCR在疾病诊断中的应用第二节 高质量质谱技术一、基本原理二、SELDI-TOF-MS技术在疾病诊断中的应用第三节 微流控芯片一、微流控芯片发展过程二、微流控芯片原理三、微流控芯片制作四、微流控芯片在疾病诊断中的应用第四节 纳米生物传感器一、纳米生物传感器基本概念二、纳米颗粒的特性三、纳米生物传感器分类纳米生物传感器在疾病诊断中的应用本章学习目标重点：分子生物学检验新技术的发展方向难点：新技术的原理和应用数字PCR数字P

4、CR技术是核酸绝对定量技术之一。数字PCR的概念在1992年，由Sykes等人在基于样品稀释和泊松分布数据处理的巢式PCR定量技术基础上提出。近年来，Heyries等报道了一个百万级的微流体dPCR，成为了该技术的一大突破。数字PCR技术分类目前数字PCR技术主要有三类p 微反应室/孔板p 大规模集成微流控芯片p 液滴数字PCR系统数字PCR技术原理Digital PCR Principle&Advantages.mp4数字PCR技术包括PCR扩增和荧光信号分析两部分。dPCR在进行扩增反应前，将含有DNA模板的PCR溶液稀释，通过稀释分离成成单分子，分布到大量的独立反应室，并且各自进行PCR

5、扩增。在扩增结束后，对每个反应单元的荧光信号进行采集，然后利用泊松分布公式计算样品原始浓度或含量。数字PCR在疾病诊断中的应用肿瘤诊断感染性疾病诊断产前诊断微流控芯片技术微流控芯片(microfluidic Chip)又称微型全分析系统，或者芯片实验室（Lab on a Chip）这种芯片技术，融合了分析化学、微机电加工、计算机科学、电子微流控分析仪器学、材料学、生物学和医学等多学科交叉融合而成的技术。目标是 实现从样品处理到检测的整体微型化、自动化、集成化、和便携化。微流控芯片发展过程1979年，斯坦福大学造出第一个微流控设备1990年，提出微流控芯片技术概念1995年，实现微流控芯片DNA

6、测序1999年，商业化微流控仪器出现2000年以后，大规模集成微流控芯片出现微流控芯片制作原理Microfluidics Adventures#3-Microfluidic Chips.mp4微流控芯片在疾病中的应用感染性疾病检测肿瘤诊断p Lab on a Chip Transforms Cancer Diagnosis and Treatment.mp4遗传性疾病诊断分离胶的制备蛋白质组学的定义蛋白质组：是指一个细胞、一类组织或者一种生物的基因组所表达的全部蛋白质。它是特定时间和空间条件下所有蛋白质的集合，是动态变化的综合。蛋白质组学：是以蛋白质组为研究对象，从整体水平揭示细胞内动态变化的

7、蛋白质组成、结构、表达水平和修饰状态，研究蛋白质之间、蛋白质与生物大分子之间的相互作用，揭示蛋白质的功能与生命活动的规律p 结构蛋白质组学p 差异蛋白质组学p 定向蛋白质组学p 功能蛋白质组学p 疾病蛋白质组学蛋白质凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是目前分离蛋白质最可靠的技术之一。p 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）p 非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的

8、二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为 特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分 子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线

9、，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它 的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。蛋白質電泳膠體製備.mp4蛋白質電泳.mp4SDS PAGE.mp4蛋白质电泳1 SDS-PAGE 蛋白样品制备p 蛋白质样品应完全溶解，解聚和变性 样品处理试剂包括变性剂、还原剂、去垢剂p 蛋白质样品应防止降解 加入适宜的蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等）在低温下处理样品2 凝胶制备(1)分离胶制备：根据不同分子量的需要，按表1制成分离胶溶液，灌入模具内至一定髙度，加水封顶，室温下聚合(室温不同，聚合时间不同)。(2)浓缩胶制备：待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入按表2配制的浓缩胶溶液，

10、插入样品梳，注意避免气泡出现。浓缩胶的制备3 电泳（1）上样：待浓缩胶溶液聚合后，小心拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽。进行纯度和杂质检查时，在加样孔中加入供试品溶液与对照品/标准品溶液不低于1g(银染法)或10g以上(考马斯亮蓝染色法)。进行鉴别和分子量测定试验时，可根据产品特性酌情降低上样量。（2）电泳：恒压电泳：初始电压为80V，进入分离胶时调至120 200V，当溴酚蓝迁移胶底处，停止电泳。考马斯亮蓝法4 染色 考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝和蛋白质的氨基、羧基基团产生静电作用，而非共价作用。染料分子和蛋白分子形成一个蛋白质-染料分子复合物。这种复合物的形成，使得染料的带负电荷的形态得到了

11、稳定，从而产生蓝色。R-350检测灵敏度最高 R-250比G-250 灵敏度高检测限度在10300ng胶体考马斯亮蓝G250用于聚丙烯酰胺凝胶蛋白染色，检测灵敏度10ngG-250 R-250Bradford蛋白定量法的理论依据，是一种利用考马斯亮蓝与蛋白质结合的蛋白质测定方法。这种染料与蛋白质的结合，使得考马斯亮蓝的吸收峰从465nm迁移到595nm。记录595nm处吸光度的增加，可以用来测定蛋白质浓度。银染法银染色法的原理：蛋白质条带中的氨基酸功能基团与硝酸银中的银离子能发生结合。用相关试剂将银离子转换为带有黄棕色的金属银。银染检测灵敏度可以达到0.1ng/蛋白点雪崩效应：银染色条带的深浅

12、与蛋白质的量不成正比，因此不能定量蛋白质的多少。荧光染色如果将荧光蛋白质凝胶染色与相应的图像仪组合起来，将是一种比 Coomassie 和银染更好的蛋白分析方法。荧光凝胶染料具有宽广的线性范围、更高的灵敏度以及质谱分析兼容性等优势。SYPRO Ruby是一类钌（II）的有机络合物，能与碱性氨基酸相互做用而染色蛋白质。灵敏度达1ng/蛋白点；价格昂贵SYPRO Ruby 蛋白凝胶染料是适用于双向电泳的使用最广泛的凝胶染料，与质谱法以及基于 Edman 的测序应用相容。可使用紫外或蓝光透射仪或激光扫描仪显示它。荧光染色双向凝胶电泳双向凝胶电泳是利用蛋白质的自身电荷数和分子量大小的差异，通过两次凝胶

13、电泳达到分离蛋白质的技术。第一项电泳：等电点电泳第二项电泳：SDS-PAGE等电点电泳蛋白质等电点：由于蛋白质表面离子化侧链的存在，蛋白质带净电荷。由于这些侧链都是可以滴定的（titratable），对于每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点。等电点查询网站 http:/ca.expasy.org/tools/pi_tool.html等点凝胶电泳等电点电泳样品制备p 蛋白质样品应完全溶解，解聚和变性 样品处理试剂包括变性剂、还原剂、去垢剂p 蛋白质样品应防止降解 加入适宜的蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等）在低温下处理样品p 变性剂通常为中性变性剂，还原剂采用非离子还原剂

14、，去垢剂用两性离子去垢剂（CHAPS等）。SDS的浓度必须低于2.5g/L。p 去除蛋白质中的干扰物质。等点凝胶电泳Loading the PROTEAN i12 IEF System Gel-Side Up Assembly.mp4How to Run a 2-D Electrophoresis Gel from Start to Finish.mp4IEF现在普遍使用商品化的固相PH梯度教条（IPG）IPG-IEF使用固化的电解质，它所形成的PH梯度不随着电场条件而发生改变。第二向电泳前准备IPG胶条平衡：使IPG介质与第二向电泳缓冲体系一致，并保证蛋白质的变性和还原状态。双向凝胶电泳差异

15、蛋白图谱分析（一）双向凝胶电泳图谱的获取（二）双向凝胶电泳图像分析（三）双向凝胶电泳数据库双向凝胶电泳中蛋白质的定量分析（一）荧光差异显示双向电泳的基本原理（二）荧光差异显示双向电泳的评价双向电泳的的特点无法对极端分子量或等电点的蛋白以及难以溶解的的蛋白分析低丰度蛋白的检测无法改善等点漂移问题HPLC的采用是双向电泳的一个补充激光捕获显微切割技术（一）激光捕获显微切割技术原理（二）激光捕获显微切割技术的特点和应用生物质谱技术Western blot 蛋白免疫杂交技术蛋白质转移（转膜）湿转p 转膜缓冲液体系：Tris-Gly缓冲系统p 甲醇可以移去SDS-蛋白质复合物上的SDS。p 适用于大分子

16、蛋白转膜半干转p 适用于小分子量蛋白转移以及双向凝胶电泳蛋白转膜Western blot 蛋白免疫杂交技术Western Blotting Animation-Part III.mp4Western blot 蛋白免疫杂交技术蛋白质的免疫血检测p 封闭p 靶蛋白与一抗识别p 二抗结合一抗p 显色 酶促显色反应 辣根过氧化酶 发光氨（鲁米诺反应，三氨基-邻苯二甲酸盐）碱性磷酸酶 荧光标记蛋白质芯片又称蛋白质微阵列，是将蛋白质或多肽固定在固相载体表面形成微阵列，以获得蛋白质的表达、结构、功能和相互作用的信息。蛋白质芯片是一种高通量自动化平行的蛋白质分析方法，它仅依赖于分子识别而不依赖蛋白质分离。蛋白质芯片