微生物遗传学第四章细菌转移课件.ppt

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1、2023/5/31第四章第四章 细菌基因转移和基因重组细菌基因转移和基因重组2023/5/31第二节接合接合(conjugation)(conjugation)供体菌（供体菌（F+）通过性菌毛与）通过性菌毛与受体菌（受体菌（F-）直接接触，把）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，的核基因组片段传递给后者，并使其获得若干新遗传性状并使其获得若干新遗传性状的现象。的现象。大肠杆菌的接合大肠杆菌的接合能进行接合的微生物种类能进行接合的微生物种类主要在细菌和放线菌中进行。细菌中，尤其主要在细菌和放线菌中进行。细菌中，尤其G-菌较为菌较为普遍。接合还可发生

2、在不同属的一些菌种间。普遍。接合还可发生在不同属的一些菌种间。接合的意义n抗生素抗性n外毒素抗性n新的代谢能力2023/5/312023/5/31n通过接合而获得新遗传性状的受体细胞叫通过接合而获得新遗传性状的受体细胞叫接合子接合子。n介导接合作用的质粒叫介导接合作用的质粒叫接合质粒接合质粒(自主转移自主转移质粒、性质粒质粒、性质粒)。2023/5/31接合的特征接合的特征n特征特征1：需要供体细胞和受体细胞的：需要供体细胞和受体细胞的直接接触直接接触，在，在G-是通过质粒编码的是通过质粒编码的性菌毛性菌毛介导的，在介导的，在G细菌中没细菌中没有性菌毛，由受体细胞分泌类似于性激素的有性菌毛，由

3、受体细胞分泌类似于性激素的短肽短肽刺刺激细胞接合。激细胞接合。2023/5/31n特征特征2：需要：需要质粒参与质粒参与。G-细菌中质粒分子量较大，细菌中质粒分子量较大，有几十个有几十个tra基因参与基因参与DNA转移，而转移，而G细菌中质细菌中质粒小，只有几个粒小，只有几个tra基因参与基因参与DNA转移。转移。2023/5/31n特征特征3：无论：无论G-或或G，质粒能，质粒能只从供体细胞向受只从供体细胞向受体细胞转移体细胞转移.n是自然界微生物遗传物质交换的重要途径。是自然界微生物遗传物质交换的重要途径。n大肠杆菌，自主转移质粒是大肠杆菌，自主转移质粒是F 因子。因子。2023/5/31

4、1.接合现象的发现与证实接合现象的发现与证实n19461946年，年，J.Lederberg&TatumJ.Lederberg&Tatum的大肠杆菌的大肠杆菌杂交试验杂交试验：材料：大肠杆菌材料：大肠杆菌(E.coliE.coli)K12)K12菌株的两个营养缺陷型品系：菌株的两个营养缺陷型品系：n菌株菌株A A甲硫氨酸缺陷型甲硫氨酸缺陷型met-met-和生物素缺陷型和生物素缺陷型bio-bio-；n菌株菌株B B苏氨酸缺陷型苏氨酸缺陷型thr-thr-和亮氨酸缺陷型和亮氨酸缺陷型leu-leu-。方法：将方法：将A A、B B两菌株混和，在基本培养基两菌株混和，在基本培养基(固体固体)上涂

5、布培养。上涂布培养。结果：平板上长出原养型菌落结果：平板上长出原养型菌落(+)(+)。2023/5/31+-？结果原养型菌株以结果原养型菌株以10-510-6的频率出现的频率出现2023/5/31n 质疑：n 细菌的杂交实验获得的重组子可能是转化的结果。n 培养基中含有某些代谢产物，混合后这些产物互相补充了对方的不足而得以在基本培养基上生长。n(3)回复突变2023/5/31转化的排除（1）n当时当时Lederberg 和和Tatum已证明，把菌株已证明，把菌株A的培养液经过灭菌，再加入到的培养液经过灭菌，再加入到B菌株的培养菌株的培养液中，没有原养型菌落，说明并非转化的液中，没有原养型菌落，

6、说明并非转化的结果。结果。2023/5/31证实接合过程需要细胞间的直接接触的证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管型管实验（实验（Bernard Davis，1950）转化的排除(2)2023/5/31互养的排除互养的排除n营养缺陷型菌株通过培养基交换养料而生长的现营养缺陷型菌株通过培养基交换养料而生长的现象称为象称为互养互养。如将基因型。如将基因型A A-B B+T1T1s s和和A A+B B-T1T1r r两菌株两菌株在基本培养基上混合培养，接触较短的一段时间在基本培养基上混合培养，接触较短的一段时间以后，喷上噬菌体以后，喷上噬菌体T1,T1,把把A A-B B+T1T1s s杀

7、死，经培养后仍杀死，经培养后仍有原养型菌落出现。有原养型菌落出现。A A-B B+T1T1s sA A+B B-T1T1r rT1T12023/5/31回复突变的排除回复突变的排除n大肠杆菌的突变率一般都是大肠杆菌的突变率一般都是10-8，若两个基因同，若两个基因同时回复突变，则可能性只有时回复突变，则可能性只有10-16，这种几率在平，这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培养能出现板上是很难检测到的，所以混合培养能出现10-5-10-6频率的菌落一定是重组的结果。频率的菌落一定是重组的结果。MCB 140 2/16/05 1514.11J.Lederberg,E.Tatum(1946)N

8、ovel genotypes in mixed cultures of biochemical mutants of bacteria.Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.11:113-114.MCB 140 2/16/05 16草履虫2023/5/31W.Hayes的实验（1952）n该实验说明细菌接合过程中该实验说明细菌接合过程中遗传物质的转移是单向的遗传物质的转移是单向的，即遗，即遗传物质从传物质从A A株转移到了株转移到了B B株。株。A:met-bio-thr+thi+B:met+bio+thr-thi-2023/5/31大肠杆菌的两种类型大肠杆菌的

9、两种类型nHayes(1952)研究表明：大肠杆菌两种不同菌株(品系)接合过程中遗传物质的转移是单向的；从而认为大肠杆菌存在两种类型：雌性与雄性，分别作为接合过程中遗传物质的受体与供体。供体菌称为供体菌称为雄性菌雄性菌，受体菌称为，受体菌称为雌性菌雌性菌。n有学者认为，具有性菌毛的细胞可以叫做雄性，这种细丝状的菌毛像一种分子阴茎，与缺乏性菌毛的雌性细胞交合（德迪夫1999）。n威廉斯（2001）的观点：“在细菌和病毒以及在所有高等生命体的主要类型中，遗传重组现象的存在表明，性别的分子基础是来自远古的进化演变的产物”。2023/5/312023/5/312.F2.F质粒的发现质粒的发现n证明了细

10、菌的接合是遗传物质的单向转移后，证明了细菌的接合是遗传物质的单向转移后，HayesHayes偶然发现了作为原始供体的偶然发现了作为原始供体的A A菌在冰箱里存菌在冰箱里存放了一年后出现一种变种，变种和正常的放了一年后出现一种变种，变种和正常的B B菌杂交菌杂交时缺乏将遗传物质传给时缺乏将遗传物质传给B B菌株的能力。菌株的能力。n他把这个不育变种的一个他把这个不育变种的一个StrStrr r 突变型分离出来，突变型分离出来，并把它和可育的并把它和可育的StrStrs s A A菌株一起繁殖，将其涂布菌株一起繁殖，将其涂布在含有链霉素的平板上，分离后再和在含有链霉素的平板上，分离后再和B B菌株

11、杂交，菌株杂交，结果使不育的菌株回复了可育性（大约结果使不育的菌株回复了可育性（大约1/31/3恢复）。恢复）。2023/5/31大肠杆菌的可育性解释大肠杆菌的可育性解释u A A菌株之所以能成为供体，是因为它含有菌株之所以能成为供体，是因为它含有一个性因子（一个性因子（sex factorsex factor），又称致育因），又称致育因子（子（fertility factorfertility factor），简称），简称F F因子。因子。2023/5/31F F因子的特点因子的特点大肠杆菌的供体或雄性细胞记为大肠杆菌的供体或雄性细胞记为F F，带有一个，带有一个性因子或致育因子性因子或致育

12、因子F F，而另一个不带性因子，而另一个不带性因子F F的的受体细胞或雌性细胞记为受体细胞或雌性细胞记为F-F-杂交杂交F+F+F F是可育的，杂交是可育的，杂交F-F-F-F-是不育的是不育的F F因子可以转移，从因子可以转移，从F+F+到到F-F-，但必须通过细胞接，但必须通过细胞接触触F F因子能自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除因子能自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从一个非从一个F+F+再把它传递过来。再把它传递过来。2023/5/31 F F+是一种遗传性状，是一种遗传性状，F F因子的存在使细菌称为因子的存在使细菌称为F F+，F F因子因子的丧失使细菌成为的丧失使细菌成为F

13、F-，F F+分裂仍得到分裂仍得到F F+细胞。细胞。其特性类似于染色体，但染色体基因转移的频率不超过其特性类似于染色体，但染色体基因转移的频率不超过1010-6-6，F F因子转移的频率高达因子转移的频率高达7070以上。以上。n因此，因此，F F因子就是质粒因子就是质粒Lederberg,J.,Cavalli,L.L.,and Lederberg,E.M.,Nov.1952,Sex compatibility in Escherichia coli,Genetics 37(6):720-7302023/5/313.F3.F质粒的结构质粒的结构n已经对已经对F F质粒的基因组进行了全序列测定

14、。质粒的基因组进行了全序列测定。F F质质粒为双链环状粒为双链环状DNADNA分子，分子，DNADNA长度为长度为99159bp99159bp（约（约100kb100kb），约是大肠杆菌基因组的），约是大肠杆菌基因组的2 2，其，其中中1/31/3的基因与接合作用有关。的基因与接合作用有关。n整个基因组由整个基因组由3 3个主要区段组成：个主要区段组成：转移区、复转移区、复制区、插入区。制区、插入区。2023/5/312023/5/31转移区转移区n转移区的长度为转移区的长度为33kb33kb，由，由2323个基因组成，构个基因组成，构成一个成一个tratra操纵子。操纵子。n与性菌毛的形成有

15、关。与性菌毛的形成有关。n控制基因转移控制基因转移n该区最后进入受体细胞该区最后进入受体细胞2023/5/31复制区复制区n复制区负责复制区负责F F质粒的自我复制，质粒的自我复制，F F质粒的自主复制质粒的自主复制区为区为oriVoriV，在，在oriVoriV中包含复制起点。中包含复制起点。nF F质粒的复制是按质粒的复制是按型方式进行双向复制型方式进行双向复制，是一种，是一种严紧型质粒，严紧型质粒，1-21-2拷贝拷贝/细胞。细胞。nIncInc基因产物使细胞具有基因产物使细胞具有不相容性不相容性。2023/5/31插入区插入区n包含包含4 4个插入顺序：个插入顺序：2 2个个IS3IS

16、3，一个，一个IS2IS2，1 1个个Tn1000Tn1000，它们与，它们与F F质粒的整合、切除和易位有关。质粒的整合、切除和易位有关。2023/5/31F F因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细胞因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上内独立存在，也可插入（整合）到染色体上2023/5/31高频重组高频重组(High frequence(High frequence recombination,Hfr)recombination,Hfr)1951年 Cavalli发现用氮芥处理F 然后将处理后的FF 104 1954年 Hayes 也分离了Hfr品

17、系，发现：(1)Hfr使重组能力增加，但无传递F因子的能力，Hfr F F (2)Hfr只能将供体基因组的一部分传给受体，Hayes的解释是Hfr的F因子发生了永久性改变。FF Hfr2023/5/314.F质粒在细胞内的存在状态质粒在细胞内的存在状态n根据细胞中是否存在因子以及其存在方式的不同，根据细胞中是否存在因子以及其存在方式的不同，可把可把E.coli分以下四种相互有联系的接合型的菌株。分以下四种相互有联系的接合型的菌株。a a）F F-菌株菌株，不含不含F F因子，没有性菌毛，但可以通过因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收接合作用接收 F F因子而变成雄性菌株（因子而变成雄性菌

18、株（F F+）；）；b b）F+F+菌株菌株，F F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c c）HfrHfr菌株菌株，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上，细胞表面有性菌毛。上，细胞表面有性菌毛。d d）FF菌株菌株，HfrHfr菌株内的菌株内的F F因子因不正常切割而脱离染色体时，因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的形成游离的但携带一小段染色体基因的F F因子，特称为因子，特称为FF因因 子。子。细胞表面同样有性菌毛。细胞表面同样有性菌毛。2023/5/312023/5/31细菌接合的电镜照片细菌接合的电镜照片2023

19、/5/315.F5.F质粒与接合作用质粒与接合作用n(1)F+F-杂交杂交n带有带有F F质粒的细胞在形态学上与质粒的细胞在形态学上与F F明显区别。除共明显区别。除共有大量的表面菌毛外，有大量的表面菌毛外，F F还有少量性菌毛。还有少量性菌毛。n接合作用分两步接合作用分两步:接合配对接合配对和和DNADNA转移转移nF F+菌株的菌株的F F因子向因子向F F-细胞转移，但含细胞转移，但含F F因子的宿主细因子的宿主细胞的胞的染色体染色体DNADNA一般一般不被转移不被转移。2023/5/312023/5/31 F F+细菌通过性毛与细菌通过性毛与F F-细菌接触并发生相互作用，细菌接触并发

20、生相互作用，产生胞质桥；产生胞质桥；F F+细菌的细菌的F F因子出现缺口，双链之一被切断，从因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移断端转移F F因子的一条链到因子的一条链到F F-细菌中。细菌中。F F因子的一条链一进入因子的一条链一进入F F-细菌中，就在细菌中，就在F F-细菌中细菌中复制新的复制新的F F因子。因子。复制完成后，复制完成后，F F-细菌变成细菌变成F F+，同时原有，同时原有F F+细胞也细胞也完成完成F F因子另一条链的复制，所以转移是因子另一条链的复制，所以转移是F F+的拷贝。的拷贝。最终最终杂交的结果杂交的结果是是F F-细菌变成细菌变成F F+细菌，而原有的

21、细菌，而原有的F F+细菌则不变。细菌则不变。2023/5/31(2)Hfr(2)Hfr F F-杂交杂交HfrHfr菌株的菌株的F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上，因此上，因此只要发生接只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给给F F-细胞并发生重组，由此为细胞并发生重组，由此为高频重组菌株高频重组菌株。n质粒通过不同的机理整合到染色体上，包括质粒和染质粒通过不同的机理整合到染色体上，包括质粒和染色体序列的同源重组。正常的重组需要两个色体序列的同源重组。正常的重组需要两个DNADNA之间有之间有同源性，但大多数

22、质粒的序列具有不同于染色体的独同源性，但大多数质粒的序列具有不同于染色体的独特性。但质粒和染色体有特性。但质粒和染色体有共同插入序列共同插入序列和和转座因子转座因子。这些转座因子间的同源重组可导致质粒的整合。这些转座因子间的同源重组可导致质粒的整合。2023/5/31插入如何产生插入如何产生Hfr?n大肠杆菌染色体有大肠杆菌染色体有7 7个个IS1IS1、1313个个IS2IS2和和6 6个个IS3IS3，F F质粒有质粒有1 1个个IS2IS2和和2 2个个IS3IS3，因此大肠杆菌染色体上，因此大肠杆菌染色体上有有1919个个ISIS介导的介导的HfrHfr形成位点。形成位点。nF F质粒

23、插入染色体上位置随机，方向随机，结果产质粒插入染色体上位置随机，方向随机，结果产生不同的生不同的HfrHfr菌株。菌株。2023/5/31HfrHfr菌菌株株的的形形成成及及其其基基因因重重组组2023/5/31HfrHfr与与F-F-菌株接合过程菌株接合过程nHfrHfr菌株仍然保持着菌株仍然保持着F F+细胞的特征，具有细胞的特征，具有F F性菌毛，性菌毛，并象并象F F+一样与一样与F F-细胞进行接合。细胞进行接合。n所不同的是，当所不同的是，当OriTOriT序列被酶识别而产生缺口后，序列被酶识别而产生缺口后，F F因子的先导区因子的先导区(leading region)(leadi

24、ng region)结合着染色体结合着染色体DNADNA向向受体细胞转移。受体细胞转移。nF F因子除先导区以外，其余部分是处于转移染色体的因子除先导区以外，其余部分是处于转移染色体的末端末端，由于转移过程常被中断，因此，由于转移过程常被中断，因此F F因子不易转入因子不易转入受体细胞中。受体细胞中。2023/5/31HfrHfr与与F-F-菌株接合结果菌株接合结果HfrHfrF F-杂交后的受体细胞杂交后的受体细胞(或接合子或接合子)大多数仍然大多数仍然是是F F-。染色体上越靠近染色体上越靠近F F因子的先导区的基因，进入的机因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在会就越多，在F F-中出

25、现重组子的时间就越早，频中出现重组子的时间就越早，频率也高。率也高。2023/5/312023/5/31（3 3）FFF-F-杂交杂交nHfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特因子，特称为称为F因子因子。nFF-与与F+F-的不同：的不同：供体的部分染色体基因随供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；）与染色体发生重组；b）继续存在于）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；因子上，形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为

26、细胞基因的这种转移过程又常称为性导性导（sexduction）、）、F因子转导因子转导（F-duction），或），或F因子媒介的转导因子媒介的转导（F-mediated transduction）。）。2023/5/312023/5/312023/5/31部分二倍体：部分二倍体：u 当当HfrHfr菌的部分染色体进入菌的部分染色体进入F F细胞后，细胞后，F F细胞中就成为部分二倍体（细胞中就成为部分二倍体（partial partial diploiddiploid）或部分合子（）或部分合子（merozygotemerozygote）。）。2023/5/316.6.中断杂交（中断杂交（in

27、terrupted matinginterrupted mating）技术）技术nHfrHfr细菌和细菌和F F-接合后，染色体按一定速度和方向进接合后，染色体按一定速度和方向进入入F F-，由于，由于DNADNA转移从转移从oriToriT起始，起始，F F质粒的主要部质粒的主要部分应该在最后进入受体，但杂交后，分应该在最后进入受体，但杂交后，F F-并不转变并不转变为为F F说明大部分说明大部分F F因子并没有进入受体。因子并没有进入受体。n利用利用HfrHfrF F-的接合过程，在不同时间取样，并把的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受样品猛烈搅拌以分

28、散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间体细菌基因型，以时间(分钟分钟)为单位绘制遗传图为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。2023/5/31中断杂交实验作图中断杂交实验作图 (interrupted matingexperiment)(interrupted matingexperiment)n中断杂交实验中断杂交实验19571957年年E.WollmanE.Wollman和和E.JacobE.Jacob设计完成设计完成供体：供体：Hfr Hfr strstrs s thr thr leuleu aziazir r t

29、on tonr r laclac galgal受体：受体：F F strstrr r thrthr leuleu aziazis s ton tons s laclacgalgal中断杂交中断杂交F FHfrHfr杂交杂交一定时间间隔一定时间间隔基本培养基基本培养基含链霉素含链霉素thr+leu+strr重组子重组子2023/5/31n将大约将大约1010倍的倍的F F-菌和菌和HfrHfr对数期的菌混合，轻轻振对数期的菌混合，轻轻振荡培养，在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌荡培养，在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌器中剧烈振荡。器中剧烈振荡。n振荡后的培养物涂布于加了链霉素的基本培养基振荡后

30、的培养物涂布于加了链霉素的基本培养基上，筛选上，筛选thrthr+leu leu+str strr r重组子。再对每一个重组重组子。再对每一个重组子的非选择性标记子的非选择性标记azi ton lac galazi ton lac gal进行测定。进行测定。2023/5/312023/5/31n从图可知，混合从图可知，混合5 5分钟后取样时，所得菌落的非选择标记分钟后取样时，所得菌落的非选择标记全部和全部和F F-菌株相同，表明还没有任何菌株相同，表明还没有任何HfrHfr菌的基因进入受菌的基因进入受体菌。混合体菌。混合1010分钟取样，重组体中有分钟取样，重组体中有1010含含HfrHfr的

31、的aziazi基因，基因，但几乎没有但几乎没有tonton和和galgal基因，基因，2525分钟时，分钟时，galgal基因才出现。基因才出现。在在6060分钟后，分钟后，thrthr+leuleu+strstrr r重组体的数目达到最高点，非重组体的数目达到最高点，非选择性供体标记趋于平衡。选择性供体标记趋于平衡。n在这些重组体之间，非选择性供体标记从在这些重组体之间，非选择性供体标记从aziazi基因的基因的9090到到galgal基因的基因的2525。因此。因此HfrHfr和和F F杂交建立起稳定的接合对杂交建立起稳定的接合对时，供体的染色体的转移是从一个固定点开始的，以时，供体的染色

32、体的转移是从一个固定点开始的，以0 0thr-leu-azi-ton-lac-galthr-leu-azi-ton-lac-gal的次序转移到受体中的次序转移到受体中。供体的基因组以匀速的方式进入受体供体的基因组以匀速的方式进入受体（3.3*103.3*104 4 bp/min bp/min）2023/5/31结论n（1）不同的非选择标记进入受体且重组的时间不同，但都是稳定的；n（2）各基因的重组频率随着时间的增加而增加，直至极值；n（3）按时间顺序，先重组和后重组的基因，重组率的极值在逐步减少；2023/5/31该方法主要根据基因转移的先后次序，以时间为单位，求基因间的遗传距离。2023/5

33、/31大肠杆菌中断杂交实验大肠杆菌中断杂交实验n大肠杆菌基因组很大大肠杆菌基因组很大（全部转移需要（全部转移需要100分钟分钟），），其遗传图谱须用多株其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成。菌才能完成。n大肠杆菌的环状基因组由中断杂交实验推测出来。大肠杆菌的环状基因组由中断杂交实验推测出来。2023/5/312023/5/31要点要点n1.接合现象的发现与证实接合现象的发现与证实n2.F2.F质粒的发现质粒的发现n3.F质粒的结构质粒的结构n4.F质粒在细胞内的存在状态质粒在细胞内的存在状态n5.F5.F质粒与接合作用质粒与接合作用n6.6.中断杂交（中断杂交（interrupted matinginterrupted mating）技术）技术2023/5/31 谢谢！练习nHfr菌株 metmet+thi thi+pur pur+F F-met met-thi thi-purpur-杂交。中断杂交试验表明，met最后进入受体，所以只在含thi或pur的培养基上选择met+接合后重组体。检验这些接合后重组体存在的thi+或pur+，发现各基因型个体数如下：n试问：n(1)选择培养基中为什么不考虑met？n(2)基因次序是什么？n(3)这里为什么不出现基因型met+thi+pur-的个体？2023/5/31