植物组织培养第6章植物的花药与花粉培养课件.ppt

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1、 植物组织培养Plant tissue culture 第六章植物花药和花粉培养花药培养简史19641964年：年：Guha&MaheshwariGuha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成南洋金花花药培养发育成胚。胚。19671967年：年：Nitsch&BourginNitsch&Bourgin花药培养获得烟草植株。花药培养获得烟草植株。19731973年：年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株。株。目前：目前：世界范围内获得单倍体植物已达世界范围内获得单倍体植物已达4242属属,75,75种以种以上，许多农作物及经济植物通过花粉培养上，许多

2、农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株。都能诱导成植株。第一节第一节 单倍体的概念及发生方式单倍体的概念及发生方式一、植物单倍体的概念 一、植物单倍体的概念 1 1、单倍体（、单倍体（Haploid Haploid）：）：指具有配子体染色体组的孢子体。或具有配子染色体数 指具有配子体染色体组的孢子体。或具有配子染色体数的细胞或个体。的细胞或个体。二、单倍体的发生方式 二、单倍体的发生方式(4(4 种 种)1 1、孤雌生殖、孤雌生殖：由胚囊中未受精的卵细胞发育成胚，进一步：由胚囊中未受精的卵细胞发育成胚，进一步发育成单倍体植物。发育成单倍体植物。2 2、孤雄生殖、孤雄生殖：在传粉后卵细胞退化

3、消失，由精细胞单性发：在传粉后卵细胞退化消失，由精细胞单性发育成为单倍体植物。育成为单倍体植物。3 3、无融合生殖、无融合生殖：由胚囊中卵细胞以外的其它细胞，发育成的：由胚囊中卵细胞以外的其它细胞，发育成的单倍体植株。如反足细胞、助细胞等。单倍体植株。如反足细胞、助细胞等。4 4、人工诱发单倍体途径、人工诱发单倍体途径：1966 1966年前 年前:人工生产单倍体方法，有激素处理、远缘杂交、人工生产单倍体方法，有激素处理、远缘杂交、延迟受粉、用照射花粉授粉。延迟受粉、用照射花粉授粉。目前 目前:离体花粉或花药培养，诱发小孢子单性发育成单倍体植 离体花粉或花药培养，诱发小孢子单性发育成单倍体植物

4、。物。花药和花粉的培养 花药和花粉的培养 离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞单性发育成 离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞单性发育成植物体。植物体。胚胎培养 胚胎培养n n 1.1.单核小孢子进行一次 单核小孢子进行一次均等分裂 均等分裂形 形成两个等同的子细胞，而不是形成 成两个等同的子细胞，而不是形成相互不同的营养细胞和生殖细胞，相互不同的营养细胞和生殖细胞，这两个子细胞进一步发育成愈伤组 这两个子细胞进一步发育成愈伤组织或胚状体 织或胚状体。（。（pathway I)pathway I)n n 2.2.单核小孢子先进行一次正常的 单核小孢子先进行一次正常的非均等分裂 非均等分裂：

5、然后通过 然后通过营养细胞 营养细胞进一步分裂形成 进一步分裂形成愈伤组织或胚状体 愈伤组织或胚状体（pathway II)pathway II)n n 营养核退化，而 营养核退化，而生殖核 生殖核进一步发育 进一步发育成单倍体植株 成单倍体植株（pathway III)pathway III)。n n 两个细胞 两个细胞都参与愈伤组织或胚状体 都参与愈伤组织或胚状体的形成。的形成。有些时候两个核融合而导 有些时候两个核融合而导致非单倍体的形成 致非单倍体的形成（pathway IV pathway IV)。三、雄核的发育途径 第二节 第二节 植物花药与花粉培养 植物花药与花粉培养一、概念 一

6、、概念 花药与花粉培养：花药与花粉培养：指离体培养花药和花粉，使 指离体培养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子体发 小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径 育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株后使之 织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株后使之二倍化的技术。二倍化的技术。雄蕊结构：花药是花的雄性器官。包括花丝、花药两部分。其中花药部分由药隔（2n）和花粉粒(1n)组成。花粉粒（也称小孢子）是由花粉母细胞经减数分裂形成。它的染色体数目为体细胞的一半，为单倍体细胞。Pollen mother cel

7、lTetradPollen forming各种植物的花粉粒表面结构各种植物的花粉粒表面结构花 花药 药与 与花 花粉 粉培 培养 养与 与单 单倍 倍体 体植 植物 物的 的形 形成 成冷处理离体花粉花粉培养多核花粉原胚花粉胚花粉胚单倍体植株愈伤组织分化单倍体愈伤组织花药增值花药培养花药花芽形成单倍体胚秋水仙素处理纯合的二倍体植株杂合的二倍体植株花药培养物花粉培养细胞培养 花药培养器官培养花药和花粉培养的基本程序外植体的选择外植体（花蕾）预处理外植体消毒剥取花药（分离花粉粒）接种诱导培养分化培养二、二、材料选取材料选取1 1、花粉发育时期的选择、花粉发育时期的选择 一般情况下，对大多数植物来说

8、，在 一般情况下，对大多数植物来说，在单核时期 单核时期（包括单（包括单核早期、中期、晚期）的花粉比较容易培养成功。核早期、中期、晚期）的花粉比较容易培养成功。培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进行细 培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进行细胞学花粉发育时期的镜检 胞学花粉发育时期的镜检（醋酸洋红）。（醋酸洋红）。(花蕾或幼穗大 花蕾或幼穗大小、颜色等形态学性状，瓣长 小、颜色等形态学性状，瓣长/药长比）药长比）四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期-小 孢 子 花 粉 粒-花粉培养 花药培养Pollen Development 2、基因型 供体植株遗传背景对花药

9、和花粉培养成败至关重要。供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重要。在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材 在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。二棱大麦比四棱和六棱大麦愈伤组织诱导率高 料来做。二棱大麦比四棱和六棱大麦愈伤组织诱导率高,小麦品种间杂种比纯种更易产生愈伤组织 小麦品种间杂种比纯种更易产生愈伤组织.3、生理状态的选择 花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的 花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接的影响。不同季节接种的花药愈伤组织诱 诱导率也有直接的影响。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。如小麦早期接种的材

10、料比晚期接种的 导率也有显著变化。如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈伤组织诱导率可提高 材料愈伤组织诱导率可提高2 2 3 3倍。倍。44、外植体预处理对花粉培养的影响、外植体预处理对花粉培养的影响（1）低温度处理：Nitsch（1973）低温处理可以明显提高花粉胚的诱导率，3下保存48h，花粉胚的诱导率提高了33.6%。低温处理对农作物花药培养同样有效。烟草花药79下714d为宜；水稻处理10、48h；小麦和黑麦需在13下220d得到良好效果。低温处理的作用机理就目前来看有两种观点：一种认为低温可以改变花粉粒第一次有丝分裂的纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，结果使得花粉朝着胚胎方向发育；另

11、一种观点认为低温的作用是使花粉保持了较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。n n（2 2）离心处理）离心处理 Tanaka Tanaka（1973 1973）将单核后期的烟草花药）将单核后期的烟草花药在 在10000 10000 11000r/min 11000r/min的速度下离心 的速度下离心30min 30min，产生小植株的，产生小植株的频率从 频率从30.5%30.5%提高 提高38.2%38.2%，每个花药产生的小植株数目从对，每个花药产生的小植株数目从对照的平均 照的平均1.6 1.6株提高到 株提高到5.4 5.4株。株。n n（3 3）乙烯处理）乙烯处

12、理 Bennett Bennett和 和Hughes(1972)Hughes(1972)在研究小麦化学 在研究小麦化学去雄时注意到，在减数分裂前用乙烯利喷施植株，促使 去雄时注意到，在减数分裂前用乙烯利喷施植株，促使花 花粉细胞核发生分裂 粉细胞核发生分裂。王敬驹（。王敬驹（1979 1979）在培养基中及植株上）在培养基中及植株上分别施加乙烯利，小麦花药培养基中较低浓度的 分别施加乙烯利，小麦花药培养基中较低浓度的乙烯利 乙烯利（40 40 80ppm 80ppm）对花粉的愈伤组织的形成有促进作用 对花粉的愈伤组织的形成有促进作用。三、三、花药和花粉培养技术 花药和花粉培养技术1 1 花药培

13、养 花药培养 将发育到一定阶段的花药，培养在人工合成的培养基上，将发育到一定阶段的花药，培养在人工合成的培养基上，使花药内花粉粒的发育途径发生改变，形成花粉胚或花 使花药内花粉粒的发育途径发生改变，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体或愈伤组织分化成植株。操 粉愈伤组织，随后由胚状体或愈伤组织分化成植株。操作程序简单，不需要游离花粉，不需要特殊培养装置。作程序简单，不需要游离花粉，不需要特殊培养装置。花药培养产生的花粉植株一般有 花药培养产生的花粉植株一般有两条途径 两条途径：A.A.花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株，例如烟草、花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株，例如烟草、曼佗罗等

14、。曼佗罗等。B.B.花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再诱导分化植株。花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再诱导分化植株。2 2、花粉培养、花粉培养 从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍 从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植株的技术，又称 体植株的技术，又称小孢子培养 小孢子培养。特点 特点:它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，可以获得大量的花粉植株，相当于单细胞培养。可以获得大量的花粉植株，相当于单细胞培养。1 1）花粉的分离）花粉的分离 分离法：分离法：自然散落法 自然散落法(

15、液体培养基培养 液体培养基培养3-7 3-7天 天,花粉开裂释放小孢子 花粉开裂释放小孢子,转移培养 转移培养)、挤压法 挤压法、机械游离法 机械游离法（磁力搅拌）。（磁力搅拌）。2 2）花粉培养的方式：）花粉培养的方式：平板培养 平板培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花粉胚状体，最：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花粉胚状体，最终分化为植株。终分化为植株。液体浅层培养 液体浅层培养:悬浮培养。悬浮培养。双层培养 双层培养：上：上-液体 液体+下 下-固体。固体。看护培养 看护培养：花粉：花粉-滤纸 滤纸-固体培养基。固体培养基。微室培养 微室培养：在凹形载玻片中悬滴培养。：在凹形

16、载玻片中悬滴培养。3）材料消毒花蕾用70%的酒精浸泡30秒。无菌水清洗。无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分。放入0.1%的氯化汞溶液中24分钟（也可为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）。无菌水冲洗35次 用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。4 4）培养基选择）培养基选择 花药培养培养基有 花药培养培养基有MS MS、N6 N6、马铃薯培养基、马铃薯培养基、Miller Miller、Nitsch Nitsch、B5 B5等。不同基因型、花药年龄等所需营养不同。等。不同基因型、花药年龄等所需营养不同。Nitsch Ni

17、tsch、MS MS常用于双子叶植物花药培养 常用于双子叶植物花药培养；N6 N6则用于单子 则用于单子叶植物花药培养。叶植物花药培养。以后研制 以后研制C C17 17和 和W W14 14培养基，它们可以大 培养基，它们可以大幅度提高 幅度提高小麦花药 小麦花药的愈伤组织诱导率。的愈伤组织诱导率。蔗糖 蔗糖作为培养基能量物质（即碳源）及渗透压调节作用，作为培养基能量物质（即碳源）及渗透压调节作用，单子叶 单子叶植物需要 植物需要较高 较高浓度蔗糖（浓度蔗糖（5%5%15%15%）；）；双子叶 双子叶植物 植物较低 较低（3%3%左右）左右）。条件培养基 条件培养基(conditioned

18、medium)(conditioned medium)：指预先培养过花药的：指预先培养过花药的液体培养基。液体培养基。例：将大麦花药接种在 例：将大麦花药接种在N6 N6 1.5mg/L2 1.5mg/L2，4-D+0.5mg/LKT 4-D+0.5mg/LKT，每升培养基加 每升培养基加100-200 100-200枚花药，培养 枚花药，培养1 1周，除去花药的上清 周，除去花药的上清液为条件培养基。大麦花药培养在条件培养基上，愈伤组 液为条件培养基。大麦花药培养在条件培养基上，愈伤组织诱导率由 织诱导率由5%5%提高到 提高到80%-90%80%-90%。四、花粉植株的倍性 四、花粉植株的

19、倍性1 1 诱导单倍体植株的倍性 诱导单倍体植株的倍性 1)1)花药培养形成单倍体植株 花药培养形成单倍体植株。但花药中的药壁、药隔等。但花药中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。2 2）经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株）经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株的存在。黄佩霞（的存在。黄佩霞（1978 1978）统计）统计2496 2496株水稻花粉植株的染色 株水稻花粉植株的染色体数目，其中 体数目，其中单倍体占 单倍体占35.3%35.3%，二倍体占 二倍体占53.4%53.4%，多倍体和，多倍体和非整倍体占 非整倍体占

20、5.2%5.2%，二种或三种倍性以上混生的植株约占，二种或三种倍性以上混生的植株约占6.1%6.1%。3 3）激素对倍性变化有很大影响。）激素对倍性变化有很大影响。通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经过愈 通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织继代培养 愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。时间愈长，二倍体的比例愈高。2 2 单倍体植株的染色体加倍 单倍体植株的染色体加倍1 1）人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋水仙素、）人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋水仙素、富民农、对二氯苯

21、、富民农、对二氯苯、8-8-羟基喹啉等。羟基喹啉等。2 2）秋水仙素：秋水仙素：地中海生长的一种百合科 地中海生长的一种百合科植物秋水仙的种子和球茎提取出来的物质。植物秋水仙的种子和球茎提取出来的物质。溶于水、酒精，可阻止细胞有丝分裂时 溶于水、酒精，可阻止细胞有丝分裂时纺锤丝的形成。纺锤丝的形成。（1 1）小苗浸泡加倍 小苗浸泡加倍：双子叶植物烟草用：双子叶植物烟草用0.4%0.4%秋水仙素溶液处理 秋水仙素溶液处理48h 48h，加倍率为 加倍率为35%35%。（2 2）顶芽或腋芽处理加倍 顶芽或腋芽处理加倍：将适宜浓度的秋水仙素水溶液，或调和在：将适宜浓度的秋水仙素水溶液，或调和在载体羊

22、毛脂中，处理植株的顶芽或腋芽，诱导其分生组织的加倍。载体羊毛脂中，处理植株的顶芽或腋芽，诱导其分生组织的加倍。（3 3）培养基加倍 培养基加倍：用单倍体植株的营养体置于一种适当的培养基上，：用单倍体植株的营养体置于一种适当的培养基上，诱导形成愈伤组织，然后再放到分化培养基上，再生植株。诱导形成愈伤组织，然后再放到分化培养基上，再生植株。花粉培养选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）预培养数天取花药接种分离花粉v药壁向花粉提供营养物质；v通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质低温预处理消毒再生五、例子：小麦花药培养程序 五、例子：小麦花药培养程序 1 1、取材 取材：用醋酸洋红涂片镜检，选取小孢子处于

23、单核中期的麦穗，外：用醋酸洋红涂片镜检，选取小孢子处于单核中期的麦穗，外部形态为：旗叶叶耳与其下一叶的叶耳距为 部形态为：旗叶叶耳与其下一叶的叶耳距为5-15 5-15厘米。厘米。2 2、预处理 预处理：将穗子用湿纱布包好，放在塑料袋中，置于：将穗子用湿纱布包好，放在塑料袋中，置于3-5 3-5冰箱中预 冰箱中预处理 处理3-5 3-5天。天。3 3、接种 接种：70%70%表面消毒，将叶鞘剥除，无菌条件下，将颖壳上端 表面消毒，将叶鞘剥除，无菌条件下，将颖壳上端1/3 1/3剪 剪掉，镊子将花药轻轻拿出，接种到：掉，镊子将花药轻轻拿出，接种到：N6 N6+2+2，4-4-D D（2mg/L

24、2mg/L）+KT(0.5mg/L)+KT(0.5mg/L)+蔗糖 蔗糖10%10%，温度，温度25 25，暗中培养。，暗中培养。4 4、分化 分化：愈伤组织：愈伤组织1-2 1-2毫米时，转入分化培养基中，毫米时，转入分化培养基中，N6+2NAA N6+2NAA（0.5mg/L 0.5mg/L）+KT(0.5mg/L)+KT(0.5mg/L)+蔗糖 蔗糖3%3%，温度，温度25 25，光照，光照10h/d.10h/d.5 5、移栽 移栽：2 2周后，出根、芽。当花粉植株长到 周后，出根、芽。当花粉植株长到2-3 2-3个真叶时，可转入 个真叶时，可转入1/2MS 1/2MS培养基中。低温弱光

25、下练苗后可移栽于大田或温室中。培养基中。低温弱光下练苗后可移栽于大田或温室中。六、单倍体植株的应用 六、单倍体植株的应用 1 1单倍体育种 单倍体育种(haploidy(haploidy breeding):breeding):单倍体植株的染色体加倍，可 单倍体植株的染色体加倍，可形成纯合的二倍体，恢复植物育性，缩短新品种的选育周期；由于以 形成纯合的二倍体，恢复植物育性，缩短新品种的选育周期；由于以花药培养可得到大量的倍体植株。因此成为单倍体育种的有利工具，花药培养可得到大量的倍体植株。因此成为单倍体育种的有利工具，用花药培养进行单倍体育种的优点是 用花药培养进行单倍体育种的优点是缩短育种年

26、限 缩短育种年限，加速 加速F1 F1代杂合体 代杂合体的纯化 的纯化。2 2对于二倍体植物加倍变成四倍体或倍数更高的 对于二倍体植物加倍变成四倍体或倍数更高的多倍体 多倍体，可以改善，可以改善原来植物的某些经济性状。原来植物的某些经济性状。3 3对异花授粉作物（如玉米）的单倍体植株进行加倍，可迅速 对异花授粉作物（如玉米）的单倍体植株进行加倍，可迅速获得 获得自交系 自交系，免去了烦琐的人工自交过程，节省大量的时间和人力。，免去了烦琐的人工自交过程，节省大量的时间和人力。4 4排除显隐性基因干扰，有利于进行 排除显隐性基因干扰，有利于进行突变体选择 突变体选择：突变一般为隐性：突变一般为隐性

27、突变，隐性突变在二倍体中表现机会极低。对于一对杂合基因（突变，隐性突变在二倍体中表现机会极低。对于一对杂合基因（A-A-a a）而言，杂合体种子繁殖后代中显性纯合体）而言，杂合体种子繁殖后代中显性纯合体AA AA和隐性纯合体 和隐性纯合体aa aa出现 出现概率 概率1/4 1/4，而单倍体纯合出现概率，而单倍体纯合出现概率1/2 1/2。如为。如为n n对杂合等位基因，单倍 对杂合等位基因，单倍体育种比常规育种选择效率提高 体育种比常规育种选择效率提高2n 2n倍。倍。Figure 1 Pepper anther culture and haploid plants regeneration

28、（辣椒）(a)Anther at the onset of the culture.(b)Anther after 6 days in culture.(c,d)Embryos emerging from the anthers after 30 days in culture,showing roots(c)and shoots(d).(eg)Plantlets with cotyledons(e)and with leaves(f,g)subcultured in growing medium.(h)80-day-old regenerated haploid plant from ant

29、her culture(left-hand side)and a diploid control of the same age(right-hand side).Scale bars in(ad),2.5 mm;in(eh),5 mm.Biol.Cell(2005)97,709722Anther culture and plant regeneration in tomato.(A)Anther with a young callus(arrowhead)emerging from the anther locule.(B)Callus with shoot initials at its

30、surface.(C)Developing shoots,leaves,and roots over an old callus.(D)Tomato plants regenerated from anther cultures and grown in the greenhouse.Bars in A=2 mm;B,C=1cm.n n 例如，烟草 例如，烟草“早育 早育1 1号 号”，1971 1971年从杂交的 年从杂交的F1 F1植株上取下 植株上取下花药进行培养，植株加倍，当年获得种子。花药进行培养，植株加倍，当年获得种子。1972 1972年播 年播66 66株 株纯合二倍体烟草种子

31、，进行纯合度鉴定，从中选出两个较 纯合二倍体烟草种子，进行纯合度鉴定，从中选出两个较好株系。好株系。1973 1973年在大田中进行生产示范，经全国会议现场 年在大田中进行生产示范，经全国会议现场鉴定，正式确定为烟草新品种，总共经四年时间就育成了 鉴定，正式确定为烟草新品种，总共经四年时间就育成了新品种。新品种。n n 中国农科院李梅芳水稻品种的中花 中国农科院李梅芳水稻品种的中花8 8号、号、9 9号等累积推广超过 号等累积推广超过1000 1000万亩；万亩；n n 北京农林科学院胡道芬（北京农林科学院胡道芬（1984 1984）小麦新品种京花）小麦新品种京花1 1号、号、3 3号、号、5 5号等。号等。n n 1989 1989甘肃农业大学培育的甘春 甘肃农业大学培育的甘春16 16号春小麦。号春小麦。n n 广西（广西（1992 1992）玉米所育成的）玉米所育成的“桂三 桂三1 1号 号”玉米杂交种，是国内外用花 玉米杂交种，是国内外用花培方法育成的第一个玉米杂交种。培方法育成的第一个玉米杂交种。n n 武汉蔬菜研究所 武汉蔬菜研究所(2004)(2004)花药培养选育高纯度樱桃萝卜。花药培养选育高纯度樱桃萝卜。草莓花药培养再生植株花药培养选育的樱桃萝卜 花药培养选育的樱桃萝卜