备课素材：PCR中的碱基互补配对原则 高二下学期生物人教版选择性必修3.docx

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1、PCR中的碱基互补配对原则PCR技术可以特异性地快速扩增目的基因。一、基础知识PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。1.基本条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶(体外用高温代替)打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸PCR需要的组分和反应条件：（1）组分：在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的

2、DNA聚合酶;（2）反应条件：同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。2.扩增过程（1）目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合;（2）然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸,即将4种脱氧核苷酸加到引物的3端，如此重复循环多次。3.扩增结果由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。4.循环步骤：每次循环一般可以分为变性、复性（退火）和延伸三步。思考：1.MIX溶液中包含什么物质？Taq酶、4种脱氧核苷酸（TNTP）、缓冲液等。2.为什么PCR反应体系中（如

3、一支离心管）的各类物质需要按照一定比例加入？PCR循环一次，所需要的各类物质有一定的需求，根据离心管容积和循环次数，按比例加入，满足扩增需求。3.预变性的目的是什么？（时间比循环中的变性时间长很多）使DNA充分解旋为单链。“将每个样品加入对应的小孔中”，这里的“每个样品”的不同，主要是什么因素决定的？引物的种类。即引物的不同，扩增出的DNA不同。引物可以将目的基因特异性的扩增出来，依据为碱基互补配对原则。二、PCR中碱基互补配对原则1.如何将目的基因特异性的扩增出来绘图任务：以某DNA分子为模板扩增其中的目的基因，画出PCR扩增过程示意图。 思考：根据目的基因的碱基序列，采用特定的引物就可以扩

4、增出DNA分子中特定的片段。设计引物时需参照目的基因两端（选填“两端”、“内部”）的碱基序列。若以一个DNA分子为起点，进行扩增，第三轮循环后，可扩增出所需要的目的基因，个数为2，在该轮结束获得的所有DNA分子中，双链等长的占，只含1个来自反应体系的引物的DNA分子占。练习1：“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示；下图乙中均为甲通过PCR技术扩增的DNA片段。理论上推测，最早在第几轮轮循环产物中开始同时出现五种DNA片段。（）A2B3C4D8答案：B2.逆转录PCR（RT-

5、PCR）思考：用PCR技术可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另DNA链，形成双链DNA分子(如图)图由mRNA逆转录形成cDNA的过程示意图练习2：RTPCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示，以下说法不正确的是（）A设计扩增目的基因的引物时

6、需考虑目的基因两端的碱基序列B该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度C过程 需要加入缓冲液、原料、耐高温的DNA聚合酶和引物A等DG/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高答案：C解析：G/C对之间有三个氢键，G/C含量高时稳定性高，可以耐受更高的复性温度，来减少引物与DNA的“非精准”结合，进而减少非特异性扩增产物的出现。3.引物设计需注意的问题引物：引线一点就着。引物一配对就粘，不完全配对也粘。思考：PCR反应体系中的引物都是成对加入的，成对的引物之间能否发生碱基互补配对？不能。引物之间不可以发生碱基互补配对，设计时要注意避免。思考：引物长度是影响扩增产物纯净单一

7、的关键因素。实验表明，引物需要适宜长度（一般2030个核苷酸），来保证引物的特异性。如果引物设计过短或者过长，会造成什么结果呢？引物过短，会与模板的“错误”位置复性，足够长的引物可以降低“错误率”；但是长度越长并不意味着更高的特异性，较长的序列也可能出现引物局部与模板复性，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。思考：G/C对之间有三个氢键，G/C含量高时DNA的稳定性高。PCR过程中，G/C含量高的引物与模板杂合双链区可以耐受更高的复性（填环节）温度，来减少引物与模板的“非精准”结合，进而减少非特异性扩增产物的出现。据此分析，设计引物时，可以适当提高引物的G/C含量。思考：目前常用

8、的限制酶种类是有限的，为了便于目的基因与运载体的连接，需要在PCR引物设计时，包含某限制酶识别序列。该序列应加在引物的5端，成对的引物上所加的限制酶识别序列是否相同？请说明理由：不同。应该加入不同的限制酶序列，防止目的基因自身环化，保障目的基因与运载体的正确连接。（不能认为是互补）与此相关的基因工程第三步操作为：用两种不同的限制酶来切PCR产物和运载体，然后利用DNA连接酶连接目的基因和运载体。练习3：PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异性结合，二是多聚酶对引物的延伸。引物设计的总原则是提高扩增的效率和特异性。下列有关叙述错误的是（）A引物长度过短，特

9、异性降低B两种引物之间不能发生碱基互补配对C引物的GC含量越高，越利于目标DNA的扩增D可在引物的5端添加特定限制酶的识别序列答案：C练习4：通过电泳鉴定PCR的产物，结果如图所示。1号泳道为标准（Marker，不同已知长度的DNA片段混合物），2号泳道为阳性对照（目的基因片段），3号泳道为实验组。3号泳道出现了杂带，可能的原因有_。模板受到污染变性温度高引物的特异性不强复性温度偏低复性温度偏高答案：4.基因定点突变技术基因定点突变技术是一种在体外特异性地替换、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术。定点突变技术的基本操作是先合成一段含有突变碱基的DNA引物，并将这段引物杂交到含有目的基

10、因的单链DNA上，该引物特定位点的碱基与模板上的碱基不互补配对，但是其余大多数碱基与模板能够配对。然后用DNA聚合酶将剩余片段进行延伸,得到的双链DNA分子转入宿主细胞并被克隆，最后用特定的筛选方法将突变分子筛选出来(如图)。图环状DNA分子上的基因定点突变示意图判断：（1）在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等。（）（2）在上图所示的反应体系中，同时加入与图示引物互补的另一个引物，可以获得更多的突变型基因。（）如果是链状DNA分子做模板，对其进行基因定点突变，基本过程如下图所示。该基因突变的位点在图示左端，设计的引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段

11、配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点。？图链状DNA分子上的基因定点突变示意图（突变位点在端部）判断：（1）两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入。（）（2）在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8。（）（3）如果需要定点突变的位置在基因中部，上述过程无法获得突变基因。（）如果是链状DNA分子做模板，突变的位点在基因中部，可以用下图所示方法进行定点突变。图链状DNA分子上的基因定点突变示意图（突变位点在中部）判断:（1）引物2和引物3的碱基序列可以互补。（）（2）可以将引

12、物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应，进而缩短实验时间。（）（3）混合、变性后，再复性获得的杂交分子有2种，都可以用耐高温DNA聚合酶进行延伸。（）（4）A酶对杂交分子进行延伸后，应从4种引物中选择引物1和4继续进行PCR。（）（5）把需要突变的基因整合到环状DNA上，再进行定点突变，可使PCR操作更便捷。（）总结：碱基互补配对原则，是一个非常简练的知识点，但同时，它也是非常核心的知识点，平时我们对它的核心地位体验感不够，因此今天我们通过这个微专题碱基互补配对原则在PCR中的运用，增强这种体验感，学习了这节课，我们的收获主要是两个：深入理解碱基互补配对原则，

13、灵活运用碱基互补配对原则。强化练习：1.若下图为第1轮循环产生的产物。请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。（请标注两种引物的位置）2.PCR技术与电泳鉴定结合进行DNA测序。以待测序的DNA链作为模板链，使用3TATAATGCGCA-5末端结合了高灵敏度检测化合物X的DNA单链序列作为引物，在第1次实验中，用dNTP进行反应。第2次实验，在第1次实验使用上述dNTP的基础上，将反应混合物分为四个试管，分别加入四种双脱氧三磷酸核苷酸即ddNTP，即核苷酸在2、3号都脱氧（ddATP、ddCTP、ddTTP、ddGTP，结构见图1），每个试管只加一种。第1次与第2次实验四只试管，在经过相同的温度变化循环后，对反应溶液进行了适当的处理，使全部的DNA以单链DNA的形式存在。使用能区分开一个碱基长度差异的凝胶电泳法对含有化合物X的单链DNA进行分析，获得了如图2所示的结果。（1）ddNTP一旦参与聚合反应，则DNA单链延伸即终止，原因是_。（2）请根据下图写出模板链碱基序列：_。图1 图21.答案：2.答案：ddNTP的2、3号碳上都脱氧，参与聚合反应后无法与游离脱氧核苷酸形成磷酸二酯键 5TAGCGTAGTA3学科网（北京）股份有限公司