Lowry氏法测定蛋白质含量.pdf

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1、Lowry 法检测蛋白质的含量1.1.蛋白含量检测的方法蛋白含量检测的方法1.11.1 凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。1.21.2 双缩脲法双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由 1%氢氧化钾、几滴 1%硫酸铜和

2、酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位 1-10mg。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。1.2.11.2.1 双缩脲反应双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经 180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应

3、。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。1.31.3 紫外吸收法紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在 280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在 238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定。此法的特点是测定蛋

4、白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。1.41.4 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝 G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下 1h 内保持稳

5、定。该法是 1976 年 Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法还高 4 倍，Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为 01 000g/mL，最小可测 2.5g/mL 蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝 G250 染料试剂由考马斯亮蓝 G250、乙醇、磷酸组成。用于考马斯染料结合(Bradford)分析的总蛋白测量。其特点在于对蛋白样品中可能存在的大多数盐、溶剂、缓冲液、硫醇、金属螯合剂、还原性物质等均不排斥。1.5 Folin1.5 Folin 酚（

6、酚（LowryLowry）法（增加试剂图片）法（增加试剂图片）Lowry 法系根据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与 Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物中的酪氨酸和苯丙氨酸残基使酚试剂的磷钼酸盐-磷钨酸盐还原，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长 650nm 处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据蛋白样品的吸光度，计算蛋白样品的蛋白质含量。Lowry 法可检测的最低蛋白质含量达 5mg，通常测定范围是 20250mg。1.5.11.5.1 蛋白质蛋白质蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它

7、是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的 16%20%，即一个 60kg 重的成年人其体内约有蛋白质 9.612kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由 20 多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。蛋白质中一定含有碳、氢、氧、氮元素。蛋白质是由 氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。蛋白质就是构成人体组织

8、器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。1.5.21.5.2 蛋白质结构蛋白质结构蛋白质是以氨基酸为基本单位构成的生物高分子。蛋白质分子上氨基酸的序列和由此形成的立体结构构成了蛋白质结构的多样性。蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构，蛋白质分子的结构决定了它的功能。一级结构（primary structure)：氨基酸残基在蛋白质肽链中的排列顺序称为蛋白质的一级结构，每种蛋白质都有唯一而确切的氨基酸序列。二级结构（secondary structure）：蛋白质分子中肽链并非直链状，而是按一定的规律卷曲（如-螺旋结构）或折叠（如-折叠结构）形

9、成特定的空间结构，这是蛋白质的二级结构。蛋白质的二级结构主要依靠肽链中氨基酸残基亚氨基（NH）上的氢原子和羰基上的氧原子之间形成的氢键而实现的。三级结构（tertiary structure）：在二级结构的基础上，肽链还按照一定的空间结构进一步形成更复杂的三级结构。肌红蛋白，血红蛋白等正是通过这种结构使其表面的空穴恰好容纳一个血红素分子。四级结构（quaternary structure）：具有三级结构的多肽链按一定空间排列方式结合在一起形成的聚集体结构称为蛋白质的四级结构。如血红蛋白由 4 个具有三级结构的多肽链构成，其中两个是-链，另两个是-链，其四级结构近似椭球形状。1.5.31.5.3

10、 蛋白质连接方法蛋白质连接方法用约 20 种氨基酸作原料，在细胞质中的核糖体上，将氨基酸分子互相连接成肽链。一个氨基酸分子的氨基和另一个氨基酸分子的羧基，脱去一分子水而连接起来，这种结合方式叫做脱水缩合。通过缩合反应，在羧基和氨基之间形成的连接两个氨基酸分子的那个键叫做肽键。由肽键连接形成的化合物称为肽。1.5.41.5.4 氨基酸氨基酸含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物。氨基连在-碳上的为-氨基酸。组成蛋白质的氨基酸均为-氨基酸。1.5.51.5.5 吸光光度法吸光光度法吸光光度法

11、是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱法。吸光光度法是采用分光器获得纯度较高的单色光，基于物质对单色光的选择性吸收测定物质组分的分析方法。吸光光度法是借助分光光度计测定溶液的吸光度，根据朗伯一比耳定律确定物质溶液的浓度。吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况。ODOD 值值OD 值(optical density)表示某一物质在某一个特定波长下的吸光度；ABS 是吸光值 absorbance 的缩写。在分析化学里，某一化学物质都可吸收一定波长的光，并且对光的吸收度与此化学物质的浓度成正比。因此可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度。

12、其中某物质在特定波长下对光的吸收度，就是 OD 值，一般用经过石英管后的光强比上照射到石英管前的光强来表示。吸光度值（吸光度值（abs/AUabs/AU）定义）定义吸光度，absorbance，是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关，只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。吸光度用 A 表示。Aabc，其中a 为吸光系数，单位L/(gcm)

13、,b 为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位 cm，c 为溶液浓度，单位 g/L影响吸光度的因数是 b 和 c。a 是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响 c，而影响 A。符号 A，表示物质对光的吸收程度。97801 式中 I0 是通过均匀的液体介质的一束平行光的入射光的强度；It 是透射光强度；T 是透射比。A 值越大，表示物质对光的吸收越大。根据比尔定律，吸光度与吸光物质的量浓度c 成正比，以A 对 c 作图，可得到光度分析的校准曲线。在多组分体系中，如果各组分的吸光质点彼此不发生作用，那么吸光度便等于各组分吸光度之和，这一规律称吸光度的加和性。据此可以进行多组分同时测定及某些化学反应

14、平衡常数的测定。在吸光度测定中，为抵消吸收池对入射光的吸收、反射以及溶剂、试剂等对入射光的吸收、散射等因素，可选用双光束分光光度计，并选光学性质相同、厚度相等的吸收池分别盛待测溶液和参比溶液。1.5.61.5.6 朗伯比尔定律朗伯比尔定律又称比尔定律、比耳定律、布格-朗伯-比尔定律，是光吸收的基本定律，适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。朗伯比尔定律阐述为：光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。朗伯比尔定律数学表达式A=lg(1/T)=KbcA 为

15、吸光度，T 为透射比,是透射光强度比上入射光强度 K 为摩尔吸收系数.它与吸收物质的性质及入射光的波长 有关。c 为吸光物质的浓度 b 为吸收层厚度。2.Lorwy2.Lorwy 法实验材料和用具法实验材料和用具2.12.1 仪器与试剂仪器与试剂试剂：无水碳酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾、硫酸铜、福林酚试剂、牛血清白蛋白（BSA）。仪器：SP-756P 紫外分光光度计。常用玻璃器皿：量筒、试管、玻棒等。2.22.2 实验步骤实验步骤2.2.12.2.1 溶液配制：溶液配制：（1）4%碳酸钠溶液称取 4g 无水碳酸钠，加水溶解使成 100ml。（2）0.8 氢氧化钠溶液称取 0.8g 氢氧化钠，加水溶

16、解使成 100ml。（3）0.1mol/L 酒石酸钾称取 2.35g 酒石酸钾，加水溶解使成 100mL。（4）0.04mol/L 硫酸铜溶液称取 1g 硫酸铜（CuSO45H2O），加水溶解使成 100mL。（5）碱性铜试剂取试剂 4%碳酸钠溶液、0.8%氢氧化钠溶液各 25mL，试剂 0.1mol/L 酒石酸钾、0.04mol/L 硫酸铜溶液各 0.5ml 混合配制而成。2.2.22.2.2 蛋白标准溶液的配制蛋白标准溶液的配制将标准蛋白质贮备液（1mg/ml）稀释成 100g/ml 的标准工作液。2.量取标准工作液（双份）0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别加

17、入刻度试管中，补水至 1ml。试管号蛋白量（g）标准蛋白质溶液量（l）超纯水量（l）2.2.32.2.3 操作步骤操作步骤空白（2 管）1、2 3、4 5、6 7、8 9、100204060801000100020040060080010008006004002000蛋白标准溶液配置表 1精密量取供试品和阳性对照 1.0ml（双份）于刻度试管中；吸取 1.0ml 纯化水作为空白对照。加碱性铜溶液 5.0ml 到每一管中，涡旋混匀，室温条件放置 10 分钟。加酚试剂 0.5ml，摇匀，室温放置 30 分钟。使用紫外分光光度计在 650nm 处用空白对照调零后，测定标准溶液的吸光度值，以及供试品和

18、阳性对照的吸光度值。根据标准蛋白浓度和其对应吸光度的标准曲线，计算供试品和阳性对照的蛋白含量。紫外紫外-可见分光光度法（增加分光光度计的图片）可见分光光度法（增加分光光度计的图片）是根据物质分子对波长为 200-760nm 这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。波长长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线，称为吸收光谱或吸收曲线。紫外-可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长（max

19、）表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和反键电子）有关。朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。这个定律表示：当一束具有 I0 强度的单色辐射照射到吸收层厚度为 b，浓度为 c 的吸光物质时，辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。其数学表达式为：A=lg(I0/I)=lg(1/T)=bc 式中的 A 叫做吸光度；I0 为入射辐射强度；I 为透过吸收层的辐射强度；（I/I0）称为透射率 T；是一个常数，叫做摩尔吸光系数，值愈大，分光光度法测定的灵敏度愈高。比色法比色法供试品溶液加入适量显色剂后测定吸光度以测定其含量的方法为比色法。用比色法测

20、定时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后，以相应试剂为空白，在各品种规定的波长处测定各份溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。也可取对照品溶液与供试品溶液同时操作，显色后，以相应的试剂为空白，在各品种规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度，按上述（1）法计算供试品溶液的浓度。除另有规定外，比色法所用空白系指用同体积溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理制得。注意事项注意事项进行测定时，加 Folin-酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳定，但上述还原反应只在 pH=10 的情况下发生，故当 Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。