蛋白质功能研究方法及技术.pdf

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1、第二部分：蛋白质结构、功能及研究技术（曹勤红老师）-橄榄枝整理第二部分：蛋白质结构、功能及研究技术（曹勤红老师）-橄榄枝整理第一章 蛋白质的分子结构及研究技术第一章 蛋白质的分子结构及研究技术1.氨基酸的分类1.氨基酸的分类按 R 基团的极性分类a.具有非极性或疏水 R 基团的氨基酸8 种，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸/蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、缬氨酸b.具有极性不带电荷 R 基团的氨基酸7 种，丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸c.R 基团带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)2 种（pH 高于 3 时带负电荷），天冬氨酸、谷氨酸d.R 基团带正电荷的氨基酸(

2、碱性氨基酸)3 种（在生理 pH 时带正电荷），精氨酸(胍基)、组氨酸(咪唑基)、赖氨酸(-氨基)第 21、22 种氨基酸 硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸2.概念：蛋白质的一级结构、蛋白质的二级结构、蛋白质的超二级结构、蛋白质的结构域、三级结构、蛋白质的四级结构2.概念：蛋白质的一级结构、蛋白质的二级结构、蛋白质的超二级结构、蛋白质的结构域、三级结构、蛋白质的四级结构一级结构：指氨基酸在肽链中的排列顺序。注意：蛋白质一级结构和共价结构的区别：蛋白质的共价结构包括肽链的数目、末端氨基酸残基组成、氨基酸排列顺序及二硫键位置等内容。二级结构：指多肽链主链有规律的折叠和盘绕，是多肽链主链局部的空间排列。维系

3、二级结构的主要作用力是氢键。主要包括-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲等类型。超二级结构：在各种作用力的平衡下，若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的，在空间上可辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件，称为超二级结构，也称模体（motif）。主要包括 组合、组合和 组合等类型。结构域：对于较大的蛋白质分子，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，这些球状结构之间以松散的肽链相连，这些球状构象被称为结构域。三级结构：多肽链借助各种次级键和二硫键，通过盘绕折叠，形成具有特定肽链走向的紧密球状构象，称为三级结构。维持三级结构的作用力：氢键、盐键、疏水键、范德华力、二硫键。四级结构：

4、具有三级结构的球状蛋白质以非共价键彼此缔合，形成一个高度有序的功能型聚集体，称为蛋白质的四级结构。其是亚基的非共价缔合。3.蛋白质序列测定的一般策略3.蛋白质序列测定的一般策略蛋白质序列测定的一般步骤：一般步骤：（1）测序前的准备工作：包括纯化蛋白质、测定蛋白质的分子量、末端氨基酸残基的分析、确定蛋白质的肽链数目或亚基数目、测定其氨基酸组成、配基的确定（2）序列测定：包括用至少两种不同方法断裂多肽链并分离小肽段、测定每个小肽段的序列（3）多肽链的结构重建：包括确定完整多肽链的序列、确定二硫键的位置、酰胺的位置蛋白质序列测定的一般策略：一般策略：测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽

5、链（寡聚蛋白质）断开多肽链内的二硫桥 分析每一多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的 N-末端和 C-末端残基 裂解多肽链成较小的片段 测定各肽段的氨基酸序列 重建完整多肽链的一级结构确定半胱氨酸残基间形成的 S-S 交联桥的位置蛋白质功能研究方法及技术蛋白质功能研究方法及技术4.4.列举出三种测定蛋白质二级结构的方法。列举出三种测定蛋白质二级结构的方法。（1）圆二色性光谱法圆二色性：当振幅相等并同步的两束左、右圆偏振光通过光活性物质时，由于该物质对这两束光的吸收不同（对振幅减少不同），从而使左、右圆偏振光变成了椭圆偏振光，这种光学效应称为圆二色性。蛋白质的圆二色性光谱只与构象有关蛋白质的圆二色性光

6、谱只与构象有关圆二色性曲线：以摩尔椭圆度或吸光率之差为纵坐标，波长为横坐标作出的曲线，称为圆二色性曲线（圆二色性光谱、CD 光谱）（2）紫外差光谱法生色基团：分子中能够在紫外区吸收光的基团称为生色基团；差光谱：发色团的微环境决定于蛋白质分子的构象，构象改变则微环境发生变化，发色团的紫外吸收光谱也将随之变化，包括吸收峰的位置、强度和谱形状等。变化前后两个光谱之差称差光谱。一般来说，环境极性增大，引起吸收峰向短波长方向移动，称为蓝移。环境极性减小，引起吸收峰向长波长方向移动，称为红移。测定：双光束紫外分光光度计两个浓度相同只是条件（pH、溶剂、离子浓度或温度）不同的蛋白质样品分别装在参考杯和试验杯

7、中。种类：溶剂微扰差光谱、pH 差光谱、变性差光谱（3）荧光光谱法测定：测定蛋白质分子的自身荧光。向蛋白质分子的特殊部位引入荧光探测剂，然后测定荧光探测剂的荧光。蛋白质中能发射荧光的氨基酸残基：Trp（色氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Phe（苯丙氨酸）（4）激光拉曼光谱法（5）氢同位素交换法5.5.比较比较 X-X-衍射法和核磁共振法测定蛋白质三维结构的优缺点。衍射法和核磁共振法测定蛋白质三维结构的优缺点。X-X-射线晶体衍射的优越性射线晶体衍射的优越性：技术比较成熟 能够达到非常高的分辨率,1 埃 占已知结构的 80%以上,目前所有重要的蛋白几乎都是 X 射线方法解出的 几乎没有分子量的限制,2

8、00 万以上 晶体含约 40%-60%水,基本上可视为自然状态下的结构,如酶晶体有活力 收集数据快,可以全自动化 可以长出膜蛋白晶体核磁共振（核磁共振（NMRNMR）在生物大分子上应用优越性：）在生物大分子上应用优越性：不需要结晶；蛋白质三维结构测定,原子分辨率下的结构与功能研究；动态结构:溶液中,研究分子柔性与运动性及其它分子相互作用,测出一系列比较稳定的结构；复合物结构测定,分子识别；膜蛋白结构,已成功地用于菌视紫质及有机溶剂中细菌 F1F0ATP酶的 F0 膜功能区的 C 单元的结构解析。核磁共振（核磁共振（NMRNMR）的缺点：）的缺点：必须同位素标记；数据处理复杂；目前最大MW 30

9、KD,260 个残基；要求蛋白没有聚合，而且折叠良好，蛋白浓度高，量大，比较稳定；没有 X-线衍射的分辨率高,核磁谱仪非常昂贵。第二章第二章蛋白质制备原理和研究技术蛋白质制备原理和研究技术1.1.根据分子量大小分离蛋白质的方法及原理根据分子量大小分离蛋白质的方法及原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（1）不连续体系 上、下两层凝胶孔径不同；缓冲液离子组成和pH 值不同；pH 值不连续形成不连续的电位梯度（2）三种效应 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催

10、化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS：阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂：如巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT)，能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。SDS强还原剂：单体蛋白质或亚基的多肽链处于展开状态，SDS 以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比为 1.4g SDS/1g 蛋白质，相当

11、于每两个氨基酸残基结合一个 SDS 分子。2.2.根据蛋白质电荷性质不同分离的方法及原理根据蛋白质电荷性质不同分离的方法及原理等电聚焦电泳：基本原理：利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的 pH 梯度中进行蛋白质的分离和分析。根据建立 pH 梯度原理的不同，可分为：（1 1）载体两性电解质）载体两性电解质 pHpH 梯度等电聚焦梯度等电聚焦：在电泳支持介质中加入载体两性电解质，通过直流电压在正负极之间形成稳定、连续和线性的 pH 梯度。蛋白质在 pH 梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点，是一个“稳态”过程。蛋白质分子一旦到达它的等电点

12、位置，分子所带净电核为零，就不能再迁移。因此蛋白质在与其本身 pI 相等的 pH 位臵被聚焦成窄而稳的区带。这种效应称之为“聚焦效应”，它保证了蛋白质分离的高分辨率。（2 2）固相）固相 pHpH 梯度等电聚焦梯度等电聚焦：利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成 pH 梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，从而形成固定的、不随环境电场等条件变化的pH 梯度。双向电泳双向电泳：双向电泳大都指第一向为等电聚焦，第二向为梯度 SDS 电泳。样品经过电荷和质量两次分离后，可以得到分子的等电点、分子量等信息。分离的结果不是带，而是点。3.3.亲和层析纯化带有组氨酸标签（或亲和层析

13、纯化带有组氨酸标签（或 GSTGST 标签）重组蛋白的原理和方法标签）重组蛋白的原理和方法金属螯合层析：利用固定相偶联的配基亚胺基二乙酸（IDA)与二价金属离子发生螯合作用，该金属离子又与蛋白质分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸结合。利用这种特性进行层析分离的方法，称为金属螯合层析。金属螯合层析用途很广，尤其是分离某些重组蛋白的末端带有组氨酸标签的生物大分子极为有利。利用 His Tag标签进行亲和层析：a.构建表达载体，使目的基因带上 His Tag标签b.表达带有 His Tag标签的目的蛋白c.用 Ni Sepharose HP（GE Healthcare）等介质亲和纯化目标蛋白4.4

14、.测定蛋白质浓度的方法和原理测定蛋白质浓度的方法和原理5.5.盐溶和盐析的概念及原因盐溶和盐析的概念及原因盐溶：低浓度时中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(salting in)。盐析：当溶液的离子强度增加到足够高，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析(salting out)。盐溶的原因：低浓度盐存在时，蛋白质分子吸附少量相反电荷的盐离子后，双电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因此增加了蛋白质的溶解性。盐析的原因：水的活度降低（1）原来溶液中大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水；（2）原来被迫与蛋白质表面的

15、疏水基团接触的水分子被移去溶剂化盐离子，疏水基团被暴露，疏水相互作用使蛋白质聚集而沉淀。6.6.亲和层析的概念及一般程序亲和层析的概念及一般程序亲和层析概念：利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。一般程序：1.选择被分离蛋白质的配体（关键），将配体以适当的形式连接到支持物上（如琼脂糖）。2.将支持物配体络合物以适当的缓冲夜装在柱中。3.蛋白质混合物上到柱顶部。大多数蛋白质径直通过柱，能与配体相互作用的蛋白质被阻留或被固定在柱上。4.洗柱，除去不需要的蛋白质。5.用适当的方法将吸附在柱上的蛋白质洗下来。第三章第三章蛋白质的结构与功能蛋白质的结构

16、与功能1.牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶 A A 的变性和复性过程的变性和复性过程;牛胰核糖核酸酶 A 经尿素和巯基乙醇处理由天然、有活性的状态变为去折叠状态，二硫键被还原，失去活性；再经除去尿素和巯基乙醇，又恢复天然构象，二硫键重新形成，活性恢复。2.2.肌红蛋白、血红蛋白在进化中形成的多肽微环境作用肌红蛋白、血红蛋白在进化中形成的多肽微环境作用;（1）固定血红素基；（2）保护血红素铁免遭氧化；（3）为氧气分子提供一个合适的结合部位。3.3.分析血红蛋白与肌红蛋白的氧结合曲线分析血红蛋白与肌红蛋白的氧结合曲线对于肌红蛋白得到的是一条双曲线；而对于血红蛋白得到的是一条 S 型曲线。一个肌红蛋白分

17、子只能结合一分子氧，而血红蛋白却可以结合四分子氧，所以描述氧结合血红蛋白的方程比肌红蛋白就更复杂。S 型曲线表明当第一个分子氧结合血红蛋白时并不有利，可是一旦发生结合，就使得其它的氧分子更容易与余下的 3 个血红素结合。4.4.别构效应的概念别构效应的概念大多数寡聚蛋白质调节它们的生物活性都是借助于亚基相互作用。多亚基蛋白质一般具有多个结合部位，结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子的其它部位所产生的影响（如改变亲和力或催化能力）称为别构效应。5.Bohr5.Bohr 效应的概念及生理学意义效应的概念及生理学意义BohrBohr 效应的概念效应的概念：增加 CO2 浓度（降低 pH），能降

18、低 Hb 对氧的亲和力，促进氧从 Hb 的释放，这种现象称为 Bohr 效应。BohrBohr 效应的生理意义效应的生理意义：当血液流经组织特别是代谢迅速的肌肉时，由于这里 pH 较低，CO2 浓度较高，因此有利于血红蛋白释放 O2，使组织比单纯的 pO2 降低获得更多的氧，而氧的释放又促使 Hb 与 H+和 CO2 的结合，以补偿由于组织呼吸作用形成的 CO2 所引起的 pH 降低，起着缓冲血液 pH 的作用。当血液流经肺部时，由于肺 pO2 高，有利于 Hb 与 O2 结合并因此促进 H+和 CO2 的释放，同时 CO2 的呼出有利于氧合血红蛋白的生成。6.6.镰刀形细胞贫血病的分子机理镰

19、刀形细胞贫血病的分子机理正常的血红蛋白是由两条 链和两条 链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红素相连接。链由 141 个氨基酸组成，链由 146 个氨基酸组成。镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。其 基因发生单一碱基突变，正常 基因第 6个密码子为 GAG，编译谷氨酸突变后变为GTG 编译缬氨酸，这种单个氨基酸的替代影响了血红蛋白的正常合成，使其形态和性质发生了变化，导致镰刀型贫血症。7.7.抗原、半抗原、抗体的概念抗原、半抗原、抗体的概念抗原：能引起免疫反应的任何分子或病原体称为抗原(antigen)半抗原：本身无抗原性，与载体蛋白结合后有

20、了抗原性的物质称为半抗原(hepten)抗体（免疫球蛋白）：是动物为反应外来物质的出现而合成的一种球蛋白。能与外来物质专一地结合，从而消除外来物质对机体的毒害作用。8.8.免疫荧光标记的原理（一般步骤）免疫荧光标记的原理（一般步骤）a 用化学方法将荧光素(fluorescein)与抗体结合，但不影响抗原-抗体结合的活性；b 用荧光抗体处理固定过的标本，在荧光显微镜下观察荧光的出现，可用以鉴定标本中的抗原，并进行抗原的定位。c 用高密度颗粒，如铁蛋白，胶体金与抗体偶联，然后利用电镜观察对结合部位进行高分辨率观测。9.9.酶联免疫的应用酶联免疫的应用酶联免疫操作步骤操作步骤（抗抗型）：a 待测样品

21、中的蛋白质吸附到惰性表面，通常使用 96#的聚苯乙烯塑料板。b 表面加非特异性蛋白质温育，封闭未被蛋白质覆盖的部位。c 用含抗待测蛋白质的抗体（一抗）溶液处理。d 洗去未结合的抗体并与二抗温育。与二抗共价连接的酶可催化无色或无荧光底物变成有色或荧光产物。e 通过测量颜色和荧光的密度来确定样品中抗原的含量。酶联免疫的应用酶联免疫的应用a 定量生物样品中相应抗原的数量；b 易于检测，可以定量少于 10-9g 的专一抗原蛋白。10.10.免疫印迹免疫印迹(Western blotting)(Western blotting)的原理及一般步骤的原理及一般步骤原理：原理：将混合抗原样品在凝胶板上进行单向

22、或双向电泳分离,然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下,使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上,并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等,对抗原固定化基质膜进行检测和分析。基本步骤：基本步骤：免疫印迹法基本上可分为凝胶电泳、转移、封闭、一抗、酶标二抗、底物显色等步骤。第四章第四章蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用的研究方法免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-ImmunoprecipitationCo-Immunoprecipitation）以抗体和抗原之间的特异结合为基础，研究蛋白质相互作用；当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的

23、许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体来免疫沉淀 X，那么与 X 在细胞内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。酵母双杂交（酵母双杂交（Yeast Two-hybrid SystemYeast Two-hybrid System）原理：酵母的转录激活因子 GAL4，在 N 端有一个由 147 个氨基酸组成的 DNA 结合域(DNA bindingdomain，BD)，C 端有一个由 113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain，AD)。GAL4 分子的 DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activat

24、ing sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活 UAS 下游的基因进行转录。但是，单独的 DNA 结合域和单独的转录激活域都不能起作用，两者只有当结合在一起或者空间上比较接近时，才能具有完整的转录激活因子的功能。双分子荧光互补双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)BiFC)原理：利用黄色荧光蛋白(YFP)作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为相互作用而靠近，就使得荧光

25、蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。在荧光显微镜下，通过直接观察荧光变化就能确定两个目标蛋白质是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等。噬菌体展示技术噬菌体展示技术原理：噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。Pull-downPull-down 技术技术原理：Pull-down 技术是将已带有标记的饵蛋

26、白（如生物素标记、His-tag 或 GST-tag）固相化，通常是将饵蛋白通过其上融合的标签特异地结合到相应填料上，再与待检验互作的目标蛋白在填料上结合（目标蛋白不带标签或者与饵蛋白带不同标签），然后用洗脱缓冲液将填料上的饵蛋白洗脱下来，最后应用聚丙烯酰胺凝胶电泳或者免疫印记分析洗脱出的蛋白溶液成分，从而确定饵蛋白与目标蛋白是否在体外形成了复合物。Far-westernFar-western 技术技术原理：Far-western 技术是在 Western-Blot 的基础上建立的。将饵蛋白经SDS-PAGE 电泳分离，并且转膜后，与待检验的目标蛋白溶液孵育，通过一抗、二抗对待检验目标蛋白的杂

27、交，最后若能能在膜上显示阳性条带，则证明膜上的饵蛋白与待检验蛋白可能存在相互作用。染色体免疫共沉淀（染色体免疫共沉淀（Chromatin ImmunoprecipitationChromatin Immunoprecipitation，ChIPChIP）原理：在保持组蛋白和 DNA 联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”特异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的protein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。荧光共振能量转移荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理：荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)。