(11)--4-目的基因与载体的连接.ppt

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1、基因工程菌的构建-目的基因与载体连接PPPPPPPPPPP553HOOOOP=OPPPPPPPPPPP5533P磷酸二酯键连接OH 3PDNA连接酶5OH 33HO5 DNA连接酶OOOP O 学习目标掌握几种目的片段与载体的连接方式理解并掌握提高连接效率的途径利用所学知识，分析实际操作中使用的连接方式1目的基因与载体连接粘性末端连接2目的基因与载体连接平末端连接3目的基因与载体连接粘性&平末端连接4影响连接主要因素目录CONTENTS目的基因与载体连接553355335533553355335533粘性末端连接平末端连接粘性末端与平端连接01-黏性末端连接5 5GAATTCCTTAAGGAA

2、TTCCTTAAGEcoREcoR I I5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG同种内切酶产生黏性末端连接（以EcoR 为例）正向连接正向连接反向连接反向连接目的基因载体01-黏性末端连接5 5GAATTCCTTAAGEcoREcoR I I5CTGCAGAATTCG5 5 GCTT

3、AA 55 GACGTC5 退火退火AATTCG5 GCTTAA 5T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5双酶切产生黏性末端连接CTGCAGGACGTCCTGCAG GACGTCCTGCAG GACGTCPstIPstI目的基因载体02-平末端连接5 5CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSmaSma I I5CCCGGGGGGCCC5 5 CCCGGG 55 GGGCCC5 退火退火CCCGGGGGGCCC5 CCCGGG 5 GGGCCCT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseCCCGGGGGGCCC5 5CCCGGGGG

4、GCCC目的基因载体n连接效率低n使用噬菌体T4 DNA连接酶n提高连接效率的途径l提高T4连接酶的浓度l延长反应时间l控制DNA的浓度l调整目的基因片段和载体DNA摩尔比 02平末端连接同聚物加尾法连接平末端C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseTdTTdTTdTTdTdTTPdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1S1C3 5 5GTTTTT

5、TTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT目的基因载体不同黏性末端连接5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligase5 5KlenowKlenow补平补平KlenowKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGTdTTdTTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AA

6、TTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火BamH IBamH IBamH IEcoR IBamH IBamH I目的基因载体03-黏性末端-平端连接5 5GAATTCCTTAAGEcoREcoR I IAATTCG5 5 GCTTAA 55 GGGCCC5 退火退火AATTCG5 GCTTAA T4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5CCCGGGGGGCCCCCCGGG GGGCCCSmaSma I ICCCGGG 5CCCGGG5 GGGCCC04-影响连接主要因素n重组率：含有外源DNA的重组分子数与载体分子总数的比值，通常为25%75%碱性磷酸酶去除载体5磷酸基团设计带酶切位点PCR扩增引物改善DNA片段之间连接方式构建相对适宜的反应体系调整DNA片段与载体摩尔比末端脱氧核苷酸转移酶在载体3末端加寡聚核苷酸提高重组率 总结黏性末端连接平末端连接黏性末端-平端连接影响连接主要因素目的片段与载体连接感谢聆听