(29)--实验：血清r球蛋白分离提纯--PPT.ppt

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1、 生物化学与分子生物学实验 生化教研室1实验课要求实验课要求明确自己的所在分组明确自己的所在分组A 组或组或B组组线上：按照课表，线上：按照课表，提前提前10分钟分钟进入进入相应相应教师教师的的直播平台直播平台，修修改姓改姓名名线下：线下：穿白服，穿白服，提前提前15分钟分钟到到达主楼南区到到达主楼南区2楼对应实验室，楼对应实验室，不得迟到不得迟到，实验室内，实验室内禁止吃禁止吃东西东西、禁止嬉戏打闹禁止嬉戏打闹或讨论与课程无关内容或讨论与课程无关内容2血清血清球蛋白的分离提纯球蛋白的分离提纯类别：综合性实验类别：综合性实验学时：学时：8学时学时思思 考考1.什么是血清？如何制备的？什么是血清

2、？如何制备的？血清中含有哪些血清中含有哪些成分成分？举例临床？举例临床应用应用。2.实验室分离提纯蛋白质的实验室分离提纯蛋白质的样品样品及及实验方法实验方法？熟悉熟悉了解了解掌握掌握【实验目的实验目的】盐析法分离提盐析法分离提纯纯-球蛋白球蛋白的原理与方法的原理与方法凝胶层析法凝胶层析法脱盐的原理脱盐的原理和操作。和操作。醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜电泳的基本原电泳的基本原理和过程理和过程生物化学与分子生物学 蛋蛋白白质质(protein)是由许多氨基酸(amino(amino acids)acids)通过肽键(peptide(peptide bond)bond)相连形成的高分子含氮化合物。L-氨

3、基酸氨基酸是蛋白质的基本结构单位是蛋白质的基本结构单位生物化学与分子生物学 生物化学与分子生物学 1.1.蛋白质的两性电离性质蛋白质的两性电离性质 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pHpH条条件件下下都都可可解解离离成成带带负负电电荷荷或或正正电电荷荷的基团。的基团。如：如：GluGlu的的r r羧基羧基 AspAsp的的羧基羧基 LysLys的的氨基氨基 ArgArg的胍基的胍基 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质生物化学与分子生物学 当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH

4、pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷荷为为零零，此此时时溶液的溶液的pHpH称为称为 (isoelectric point,pI)。蛋白质的等电点：蛋白质的等电点：pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI蛋白质的兼性离子蛋白质的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子PNH2COOHPNH3+COOHPNH2COO-PNH3+COO-生物化学与分子生物学 2.2.蛋白质的亲水胶体性质蛋白质的亲水胶体性质 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质水化膜颗粒表面电荷蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素:生物化学与分子生

5、物学+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉生物化学与分子生物学 二、蛋白质理化性质的应用二、蛋白质理化性质的应用（一）分离纯化（一）分离纯化前处理前处理从原来的组织或细从原来的组织或细胞中以胞中以溶解的状态溶解的状态释放释放出来出来粗分级分离粗分级分离目标蛋白与其它蛋目标蛋白与其它蛋白分离，如盐析、白分离，如盐析、等电点沉淀、有机等电点沉淀、有机溶剂分级分离，除溶剂分级分离，除杂，浓缩杂，浓缩细分级分离细分级分离进一步纯化，层析、进一步纯化，层析、电泳等，最后结晶电

6、泳等，最后结晶1.透析和超滤法透析和超滤法透析（透析（dialysis）:利用半透膜将利用半透膜将大分子的蛋白质和小分子化合大分子的蛋白质和小分子化合物分离的方法物分离的方法超滤（超滤（ultrafiltration）:利用正利用正压或离心力使大分子的蛋白压或离心力使大分子的蛋白质溶液透过超滤膜而达到浓质溶液透过超滤膜而达到浓缩蛋白质溶液的目的的方法缩蛋白质溶液的目的的方法带电的颗粒，在电场中能向着与其电带电的颗粒，在电场中能向着与其电性相反方向移动的现象，称为性相反方向移动的现象，称为电泳电泳。根据支撑物的不同，可分为根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、薄膜电泳、凝胶电泳等。凝胶电泳等。影响因

7、素：影响因素：带点性质、数量带点性质、数量 分子大小、形状分子大小、形状3.电泳（电泳（electrophoresis）十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）处处理理液液:去去污污剂剂十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠（SDS）和和还还原原剂（通常为巯基乙醇）剂（通常为巯基乙醇）,一般煮沸一般煮沸35分钟分钟通通过过加加热热和和SDS可可以以使使蛋蛋白白质质变变性性，多多亚亚基基的的蛋白质也将解离为单亚基。还原剂切断二硫键蛋白质也将解离为单亚基。还原剂切断二硫键由由于于SDS是是带带有有负负电电荷荷的的分分子子，SDS通通过过它它的的长

8、的疏水尾巴与氨基酸疏水侧链结合长的疏水尾巴与氨基酸疏水侧链结合凝凝胶胶介介质质：碱碱性性，蛋蛋白白质质都都带带有有负负电电荷荷，向向阳阳极迁移极迁移 利用机械快速旋转产生利用机械快速旋转产生离心力离心力将不同物质将不同物质分离分离蛋白质在高达蛋白质在高达5050万万g g（g g为为gravity,gravity,即地心即地心引力引力 ）的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，）的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直至其直至其浮力浮力与与离心力离心力相等，此时沉降停止。相等，此时沉降停止。4.离心（离心（centrifugation）蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场中的行为用沉降系数沉降系数 (se

9、dimentation coefficient,S)表示表示,沉降沉降系数与蛋白质的密度和形状相关系数与蛋白质的密度和形状相关因因为为沉沉降降系系数数S S大大体体上上和和分分子子量量成成正正比比关关系系，故故可可应应用用超超速速离离心心法法测测定定蛋蛋白白质质分子量分子量但但对对分分子子形形状状的的高高度度不不对对称称的的大大多数纤维状蛋白质不适用。多数纤维状蛋白质不适用。待待分离蛋白质溶液（分离蛋白质溶液（流动相流动相）经过一个）经过一个固态物质（固态物质（固定相固定相）时，根据溶液中待分离）时，根据溶液中待分离的蛋白质的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力颗粒大小、电荷多少及亲和力等，等，使

10、待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的的目的 。5.层析（层析（chromatography）层析分类离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析吸附层析吸附层析分配层析分配层析亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）【实验原理实验原理】盐析盐析-向蛋白质溶液中加向蛋白质溶液中加入入中性盐中性盐（如硫酸铵），（如硫酸铵），使溶液的离子强度发生改使溶液的离子强度发生改变，使蛋白质变，使蛋白

11、质表面的电荷表面的电荷被大量中和，被大量中和，水化膜水化膜被破被破坏而沉淀析出。坏而沉淀析出。中性盐中性盐溶液溶液蛋白溶液蛋白溶液（血清）（血清）中性盐：中性盐：(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl等。等。血清中的蛋白质，用盐析的方法，可以分血清中的蛋白质，用盐析的方法，可以分离出清蛋白、离出清蛋白、球蛋白和球蛋白和-球蛋白四种。球蛋白四种。由于蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故由于蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析时所需中性盐的饱和度亦不相同，盐析时所需中性盐的饱和度亦不相同，因此因此调调节盐浓度及节盐浓度及pHpH可使各种可使各种

12、蛋白质分段沉淀蛋白质分段沉淀。分段盐析分段盐析【实验原理实验原理】清蛋白清蛋白 pI=4.9 pI=4.9 100%100%1 1 50%50%2 2 pI6 pI6 50%50%45%45%pI=7.3 pI=7.3 33%33%球蛋白球蛋白(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4浓度浓度 蛋蛋白白质质沉沉淀淀析析出出饱和硫酸铵饱和硫酸铵上清：上清：-沉淀：白蛋白、球蛋白沉淀：白蛋白、球蛋白50%硫酸铵硫酸铵上清：白蛋白（清蛋白）上清：白蛋白（清蛋白）沉淀：沉淀：1，2，-球蛋白球蛋白33%硫酸铵硫酸铵上清：上清：1，2，-球蛋白球蛋白沉淀：沉淀：-球蛋白球蛋白血清蛋白中含有白蛋白（清蛋白）

13、、血清蛋白中含有白蛋白（清蛋白）、1、2、-球蛋白球蛋白由于蛋白质的性质不同，故盐析时所需中性盐的由于蛋白质的性质不同，故盐析时所需中性盐的饱和度饱和度亦异亦异（分段盐析分段盐析）观看操作步骤观看操作步骤凝胶过滤凝胶过滤(Gel Filtration)层析层析 以具有以具有网状结构的凝胶颗粒网状结构的凝胶颗粒作为固定相，作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。凝胶层析主要是根据混合物中各种分子凝胶层析主要是根据混合物中各种分子的的分子量分子量不同，通过固定相凝胶时，分子的不同，通过固定相凝胶时，分子的扩散扩散移动速度各异移动速度各异而使大

14、小不同的分子得到分离的方而使大小不同的分子得到分离的方法。法。【实验原理实验原理】凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，此凝胶孔径大的合物流过层析柱时，此凝胶孔径大的大分子大分子量物量物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，凝胶对其阻滞作用小、流程短、而移动下移动，凝胶对其阻滞作用小、流程短、而移动速度快因此速度快因此最先被洗脱出来最先被洗脱出来；比网孔小的分子比网孔小的分子能能不同程度的自由出入凝胶孔内外，其阻滞作用大，不同程度的自由出入凝胶孔内外，其阻滞作用大，在柱内经过的路程

15、较长移动速度较慢，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗最后被洗脱出来脱出来。醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 电泳电泳：在溶液中，带电粒子在外加电场的作：在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下用下,向相反电极方向移动的现象，称为向相反电极方向移动的现象，称为电泳。电泳。醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳：利用醋酸纤维素薄膜：利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。做固体支持物的电泳技术。【实验原理】血清蛋白血清蛋白质质的等的等电电点一般低于点一般低于pH7.0，在，在pH8.6的条件下的条件下电电泳泳时时，由于其等，由于其等电电点、分子量点、分子量和分子形状的不同，向正极移和分子形

16、状的不同，向正极移动动的速度亦异，从的速度亦异，从而分离成数条区而分离成数条区带带。经经染色后由染色后由正极向正极向负负极极依次依次为为清蛋白、清蛋白、1-球蛋白、球蛋白、2-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白球蛋白五条五条带带。【实验原理实验原理】人血清中几种主要蛋白组分人血清中几种主要蛋白组分血清蛋白质血清蛋白质等电点等电点分子量分子量占总蛋白的占总蛋白的清蛋白清蛋白 4.6469,0005772 1球蛋白球蛋白 5.06200,000252球蛋白球蛋白 5.06300,00049球蛋白球蛋白 5.1290,000150,0006.512球蛋白球蛋白 6.857.3 156,000

17、950,0001220v pH=8.6巴比妥巴比妥缓冲液缓冲液v pIpH负负正极正极 清蛋白清蛋白 1 2 加样线加样线加样线加样线（纯化蛋白）（纯化蛋白）对照对照（血清）（血清）样品样品实实 验验 流流 程程分段盐析分段盐析 去除杂蛋白去除杂蛋白 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 脱盐脱盐醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 鉴定鉴定取离心管一支加入血清取离心管一支加入血清2ml加入加入2ml PBS，摇匀摇匀逐滴加入逐滴加入pH7.2饱和饱和(NH4)2SO44 4mlml,摇匀摇匀弃上清液（主要含？蛋白）弃上清液（主要含？蛋白）静置静置10分钟，再离心（分钟，再离心（3000转转/分）分）10

18、分钟分钟沉淀用沉淀用1ml PBS搅拌溶解搅拌溶解逐滴加逐滴加饱和饱和(NH4)2SO4 0.5ml,摇匀摇匀弃上清液（主要含弃上清液（主要含？蛋白）蛋白）沉淀即为初步纯沉淀即为初步纯化的化的球蛋白球蛋白脱脱 盐盐静置静置10分钟，再离心（分钟，再离心（3000转转/分）分）10分钟分钟配平配平配平配平样品为牛血清样品为牛血清电电 泳泳【盐析盐析】2ml 血清血清+2ml PBS+4ml饱和硫酸铵饱和硫酸铵静置静置10min，3000rpm,离心离心10分钟，分钟，弃上清留沉淀弃上清留沉淀沉淀沉淀+1ml PBS+0.5ml饱和硫酸铵饱和硫酸铵静置静置10min，3000rpm,离心离心10分

19、钟，分钟，弃上清留沉淀弃上清留沉淀沉淀沉淀-20保存保存重复重复1-3次次【实验结果及分析实验结果及分析】盐析次数盐析次数 实验现象实验现象 硫酸铵浓度硫酸铵浓度沉淀沉淀上清上清第一次第一次第二次第二次第三次第三次.1.盐析过程中各上清和沉淀中主要盐析过程中各上清和沉淀中主要含何种蛋白质？含何种蛋白质？2.盐析中所达到的硫酸铵饱和度各盐析中所达到的硫酸铵饱和度各是多少？是多少？3.盐析过程中有哪些注意事项？盐析过程中有哪些注意事项？【思考题思考题】装柱装柱脱盐脱盐收集收集检测检测玻璃管柱玻璃管柱垂直垂直固定于铁架上固定于铁架上，少量少量PBS液将液将气气泡赶净泡赶净，灌胶，避免出现断层，保持，

20、灌胶，避免出现断层，保持凝胶面平凝胶面平坦坦，不得使液面低于凝胶床表面不得使液面低于凝胶床表面用用PBS溶解沉淀溶解沉淀样品，滴管上样，样品，滴管上样，缓慢缓慢地进入地进入凝胶床凝胶床，反复加入反复加入PBS液液，进行进行连续洗脱连续洗脱用用10支支小试管收集洗脱液，每收集小试管收集洗脱液，每收集1ml更更换试换试管，直到管，直到10支管都收集完，关闭活塞。支管都收集完，关闭活塞。取出白瓷板，取出白瓷板，每支试管内每支试管内取取两两滴样品滴样品，分别分别加加入白瓷板入白瓷板对应对应凹凹槽槽内内，分别加入，分别加入双缩脲双缩脲和和Nessler试剂试剂，记录，记录颜色颜色变化变化【凝胶过滤层析凝

21、胶过滤层析】1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上样上样球蛋白，球蛋白，PBS PBS 1010滴滴溶解溶解 装柱装柱 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-25 流速：每分钟流速：每分钟10滴左右滴左右 加入洗脱加入洗脱剂剂PBS 10ml 收收集集【凝胶过滤层析凝胶过滤层析】【实验结果及分析实验结果及分析】管号管号12345678910Nessler试剂试剂双缩脲双缩脲试剂试剂选择（选择（？号？号）试管，解释原因。试管，解释原因。【思考题】【思考题】1.脱盐过程中，物质洗脱出来的脱盐过程中，物质洗脱出来的顺序如何？并解释为什么。顺序如何？并解释为什么。2.凝胶过滤层析过程中有哪些注凝胶过滤层析过程中

22、有哪些注意事项？意事项？泡膜泡膜点样点样电泳电泳染色染色脱色脱色醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜使用前使用前pH8.6巴比妥缓冲液浸泡巴比妥缓冲液浸泡30min以上。以上。将样品点在将样品点在无光泽面无光泽面，距离一端，距离一端1.5cm左右左右，点，点样端放在样端放在负负极测，搭桥。极测，搭桥。电泳，电泳，45min。丽春红染色丽春红染色5min。使用脱色液，洗去浮色，观察结果使用脱色液，洗去浮色，观察结果【醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳】1 1准备与点样准备与点样取两条取两条2.52.58cm8cm的膜条的膜条充分浸透在充分浸透在巴比妥缓冲巴比妥缓冲液中液中取出膜条取出膜条滤纸吸去滤纸吸

23、去多余的缓多余的缓冲液冲液无光面距一无光面距一端端1.5cm1.5cm处作处作点样线点样线点样器下端点样器下端粘上薄层血粘上薄层血清清垂直垂直点样点样【醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳】2 2电泳电泳放置放置膜条膜条点样端置于阴极点样端置于阴极点样面向下点样面向下膜条贴膜条贴紧滤纸，紧滤纸，拉直膜条拉直膜条平衡平衡10分钟分钟通电通电电压：电压：120v时间：时间：45 min关闭关闭电源电源3 3染色、脱色染色、脱色通电通电完毕完毕取出取出膜条膜条浸于染色液浸于染色液（丽春红丽春红）5min取出取出膜条膜条依次浸于依次浸于漂洗液漂洗液、各各3min直至直至漂净漂净滤纸吸滤纸吸干薄膜干薄膜

24、 醋酸纤维素膜醋酸纤维素膜的准备的准备醋酸纤维素膜（醋酸纤维素膜（2 28cm8cm）放入放入pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲液的巴比妥缓冲液 样品：样品：（1 1）-球蛋白球蛋白-前面分离提纯、浓缩前面分离提纯、浓缩（2 2）血清）血清-对照对照点样：点样：粗糙面点样粗糙面点样电泳：电泳：（1 1）将点好样的醋纤膜）将点好样的醋纤膜点样端点样端放进电泳放进电泳槽架槽架负极负极（点样面朝下点样面朝下），薄膜条要绷紧，薄膜条要绷紧，避免中间下垂避免中间下垂（2 2）缓冲液与醋纤膜之间用滤纸搭桥）缓冲液与醋纤膜之间用滤纸搭桥（3 3）盖上电泳槽盖平衡）盖上电泳槽盖平衡（4 4）接通电源）接通电源

25、电泳装置电泳装置电泳槽电泳槽染色与脱色：染色与脱色：1 1、染色、染色丽春红染色液丽春红染色液（5min5min）2 2、脱色、脱色5%5%冰醋酸漂洗冰醋酸漂洗3 3次次注意：用干净镊子夹电泳槽中的膜注意：用干净镊子夹电泳槽中的膜 污染镊子用于染污染镊子用于染色与脱色色与脱色？蛋白？蛋白？蛋白蛋白？蛋白蛋白？蛋白蛋白？蛋白蛋白？蛋白蛋白+？处？处【实验结果及分析实验结果及分析】预试结果图（供参考）预试结果图（供参考）（氨基黑染色氨基黑染色）（丽春红染色丽春红染色）A：B：【注意事项】【注意事项】1.1.薄膜的薄膜的浸润浸润与与选膜选膜是电泳成败的关键之一。是电泳成败的关键之一。2.2.点样点样

26、时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。去，吸水量以不干不湿为宜。3.3.点样点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。4.4.点样后膜条的放置：区分电极正负极，膜条点样后膜条的放置：区分电极正负极，膜条点样端接于负极且点样面向下。点样端接于负极且点样面向下。5.5.点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。不宜过多或过少。6.6.应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀。色不均匀。【注意事项】【注意事项】谢谢 谢谢