微生物遗传育种第三章突变的应用课件.ppt

《微生物遗传育种第三章突变的应用课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物遗传育种第三章突变的应用课件.ppt（94页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第三章 突变的应用 第一节诱变育种第二节营养缺陷型突变株的筛选与应用第三节抗反馈调节突变型的筛选及应用第四节其它类型突变株的筛选及应用第五节菌种退化及其防止第一节诱变育种一、概述二、诱变育种方案的设计三、诱变育种的一般步骤四、诱变育种中应注意的一些问题一、概述（一）诱变育种技术的产生与发展 工业与工程需求：发酵工业尤其是抗生素工业生产菌株选育工作的需要；理论与技术基础：Thom和Steinberg（1939）用X射线在真菌中首次诱发基因突变成功；问题探索与技术发展：Davis对各种诱变筛选程序的统计学比较；Calam对各种诱变剂量下的产量分步曲线的比较；Dahl等人对筛选工作可能误差的分析；各

2、种自动化和高通量筛选技术出现（二）诱变育种技术在育种工作的作用 提高目标产物的产量；改善菌种特性，提高产品质量，简化工艺条件；开发新产品；给代谢调控育种提供技术手段（三）高产菌株诱变育种的特点 产量是一种数量性状，数量性状的特性和基因突变的特点决定了高产菌株的诱变选育一般具有以下一些特点：盲目性大；筛选工作繁琐，工作量大；工作效率低，周期长；难以集合多个优良性状二、诱变育种方案的设计 制定明确的选育目标：一次诱变目标不可太高太多；建立可行的筛选方法：关键问题是确立一种测定产物的方法；确定诱变筛选流程：是诱变育种工作方案设计的中心内容。对于既往诱变史较少的低产菌株，采用一次高效法有利于提高育种工

3、作的进度；而对于已进行多次诱变处理的高产菌株，多步积累法优于一次高效法。三、诱变育种的一般步骤出发菌株纯化、活化、前培养（同步培养）培养液离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）单细胞或单孢子悬液活菌计数，诱变预备试验诱变处理活细胞计数，致死率计算后培养（中间培养）平板分离变异率计算初筛复筛保藏及扩大试验（一）出发菌株的选择 尽量选择既往诱变史少的高产菌株：由自然界分离获得的野生型菌株，突变可能性较大;经自然分离的生产菌株，对生产环境适应，又具野生型特性，也是良好的出发菌株;经过诱变改造的菌株，负突变可能性较大，可结合其它育种方法改变其遗传保守性（一）出发菌株的选择 挑选纯系（

4、遗传纯）菌株：避免使用丝状真菌菌丝体（异核体）；要尽量选择单倍体单核细胞（孢子），以减少诱变菌的分离延迟（结合诱变剂选择）选择对诱变剂敏感的菌株：选择一些增变突变株 采用多出发菌株 更换出发菌株 具有特定生产性状的可能性：要确有特定物的代谢途径（二）前培养 前培养的目的：p 对数中后期：生长旺盛，细胞浓度较高，对诱变剂敏感；p 同步培养物：诱变剂处理时，群体中变化一致；p 细胞内应具有丰富的内源性碱基：DNA被诱变剂作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成突变，可以获得较高的突变率。前培养的培养基：嘌呤、嘧啶碱基含量要丰富（二）前培养 丝状真菌的前培养p 产孢子真菌一般采用其孢子进行诱变，为提高

5、其对诱变剂敏感性，可以将其同步培养至孢子刚萌发的高生理活性状态（芽管的长度相当于孢子直径的0.51倍）；p 不产孢子的真菌可以采用年幼的菌丝体进行诱变处理（对尖端菌丝、单菌落边缘菌丝或小段菌丝悬浮液进行诱变处理）（三）菌悬液的制备 选择合适的介质：物理诱变常采用生理盐水作分散介质，而化学诱变则需要用缓冲液作介质。使细胞或孢子要处于良好的分散状态：利于与诱变剂解除；便于筛选玻璃株打散，脱脂棉或擦镜纸（双层）过滤 调节适当的细胞或孢子密度 酵母细胞、霉菌孢子：106107个/ml；细菌细胞、放线菌孢子：108个/ml 估计：血球计数板计数或OD法计数：平板菌落计数（四）诱变处理 1.诱变剂的选择

6、在不影响诱变效果的前提下，尽量选择毒性小、易于防护、安全性强的诱变剂；尽量选择操作简便易行、便宜易得的诱变剂；尽量选择不易发生回复突变的诱变剂：碱基置换易回复，染色体畸变、移码等不易回复 对一些既往诱变史少的低产或野生菌株，uv线往往是首选；对于经多次诱变处理的菌株，常需要能诱发染色体发生重排等较大损伤的强辐射进行处理。结合细胞的透性和生理状态进行选择 经常变换诱变剂或复合处理2.诱变剂量的选择高产菌株在低剂量时效果较好，而对多核细胞、孢子、低产菌株或质量性状处理剂量不宜过低。经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来激活；一次较高剂量的强诱变后，通常接着进行23次较低剂量的温和诱变，以利

7、于菌株遗传性状的稳定。在一次诱变中，可以分别采用不同剂量处理出发菌株，从中选出最佳剂量诱变剂量的控制方法化学诱变剂：诱变剂的浓度、处理时间和处理条件；物理诱变剂：照射距离、照射时间和照射条件X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变异的关系 形态突变型 负突变型 正突变型 紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株293#变异的关系 3.处理方法 单一诱变剂处理;复合处理：两种或两种以上诱变剂同时处理、不同的诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理以及紫外线与光复活交替处理等(注意！)乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果 1-对照；2-乙烯亚胺（浓度1:7000）；3,5,7,9-紫外线；4,

8、6,8,10-乙烯亚胺加紫外线 紫外线的剂量（erg/mm2）：3,4-2000；5,6-4000；7,8-6000；9,10-10000 3.处理方法 直接处理：在缓冲液或无菌生理盐水体系中对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离突变株；生长过程处理：在摇瓶培养基或固体平板中加入诱变剂，在菌体生长时进行诱变处理。（适用？）（五）后培养 后培养：将诱变处理过的细胞在营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯合并表达。目的：消除表型延迟 后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解液(或蛋白胨)可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各种生长因子。（六）变异菌株的分离及筛选 1.变异株的分离：多为平板分离，结合

9、快速检出法（平板预筛）根据形态变异淘汰低产菌株或筛选高产菌株；根据平皿反应淘汰低产菌株或直接挑取高产菌株2.筛选：包括初筛，复筛和终筛等。明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；产量准备提高多少等；v一次诱变目标不要太高。制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采用的培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株；每一步准备采用的分析方法等。制定筛选方案时的一些基本原则 筛选菌株的量要根据实验室的人力物力条件而定；初筛的目的是将大多数未变异菌株或负变菌株去除，这时解决的主要是量的问题，因此每株菌培养时一般只在一种培养条件下培养一瓶；培养条件一般沿用出发菌株的培养条件，分析方法也选用适于处理大量样本的、操作

10、简便而快速的方法，如HPLC,GC，比色法等（分析方法的精确性可以稍差一些）。复筛时量的矛盾已不突出，而对准确性有了更高的要求，因此复筛一般要培养23瓶，分析方法一般选用经典方法或标准方法，有时要进行几次复筛。筛选的一般步骤1株出发菌株诱变处理400个单细胞菌株初筛每株1瓶80株复筛每株三瓶16株复筛，三种工艺条件，每株各三瓶3株（对应于不同工艺条件）供生产或再次诱变使用四、诱变育种工作中应注意的问题 安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应时刻注意安全问题：个人安全和环境安全。v 个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如-射线辐射防护要求较高，uv要求较低，而化学

11、诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触；v 环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。诱变育种技术要和其他育种手段相结合。诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十分大，因此要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高其工作效率。第二节营养缺陷型突变株的筛选与应用代谢调控育种（推理育种 rational selection）：是指利用代谢调控知识指导筛选工作的育种技术。工业与工程需求：克服诱变育种筛选盲目性大、效率低的缺陷；氨基酸发酵工业的兴起 理论与技术基础：某些微生物中一些代谢产物

12、的合成途径，以及这些途径之间的关系和调控特点被揭示；诱变育种技术已经成熟 问题探索与技术发展：对微生物代谢途径的研究不断深入，越来越多的代谢途径和代谢调控方法被阐明一、营养缺陷型及其应用 营养缺陷型（auxotroph）：是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。野生型（wildtype)：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称该微生物的野生型。原养型（prototroph)：营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的、其营养要求在表型上与野生型相同的菌株。完全培养基CompleteMedium（CM）含有满足

13、某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。基本培养基MinimalMedium（MM）：不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基。补充培养基SupplementedMedium(SM)：补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。与营养要求有关的三种遗传型基本培养基MM完全培养基CM或补充培养基MM+A、MM+B野生型A+B+原养型A+B+营养缺陷型A+B-或A-B+回复突变或重组诱变（二）营养缺陷型突变株的应用 科研上：v 研究代谢途径；v 基因重组

14、的遗传标记菌种；v AA、碱基、维生素生物测定的试验菌种 生产上：v 氨基酸，核苷酸等发酵产品生产菌种的代谢调控育种；v 生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记营养缺陷型突变株在代谢调控育种中的应用 阻断代谢途径，积累中间代谢产物 例：利用谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型积累鸟氨酸谷氨酸N-乙酰谷氨酸鸟氨酸 瓜氨酸精氨酰琥珀酸精氨酸营养缺陷 反馈抑制(1)(2)SAMP AMPXMPIMPGMPR-5-PAMP脱氨酶(3)GMP还原酶阻断分支代谢，积累另一终端代谢产物例：利用XMP-生产 AMPB.subtilisC.glutamicum高丝氨酸脱氢酶(AK)解除反馈抑制，积累代谢产物如：高丝氨酸营养缺

15、陷型突变株(Hser-)条件解除（Thr+Lys)对AK的协同反馈抑制 应用渗漏突变株进行代谢调控育种p 渗漏突变株(leakage mutant)：一种遗传障碍不完全的营养缺陷型，其特点是酶的活力下降但不完全丧失，使其能少量合成某一代谢产物，但产物的量又不造成反馈抑制。p 优点：不需要限量添加生长因子。p 筛选：营养缺陷型突变株诱变 挑选在MM上生长缓慢且菌落小的回复突变株不同类型突变株积累L-赖氨酸的水平突变菌株 突变型产量(mg/ml)钝齿棒杆菌Hse-17.93钝齿棒杆菌Thr-2.33钝齿棒杆菌Thr-+Met-2.00钝齿棒杆菌AECr20.0AECr,Hse-50.0北京棒杆菌H

16、se-36.6Hse-,AECr45.0二、营养缺陷型的筛选 诱变处理：同前 后培养：在CM中进行，消除突变细胞的表型延迟（生理性延迟和分离延迟）饥饿培养：洗涤后用无氮基本培养基培养46小时，避免在淘汰野生型时营养缺陷型被误杀 淘汰野生型：降低野生型细胞的数量和比例，使营养缺陷型细胞得以相对浓缩 检出缺陷型 鉴定缺陷型淘汰野生型 原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去 方法：v 差别杀菌：利用芽孢或孢子比营养细胞更耐热的特点。将诱变处理的细菌形成芽孢，把芽孢在基本培养液中培养一段时间，然后加热杀死营养体。由于野生型芽孢能萌发所以被杀死，而营养缺陷型

17、不能萌发不被杀死。v 抗生素法：青霉素能杀死生长态的细菌而对休止态的细菌无作用 v 菌丝过滤法：适用于丝状真菌将诱变后的孢子接种至MM中，控制培养时间，使野生型长成菌丝体，通过过滤而除去菌丝体，反复几次后，剩余的多为缺陷型孢子。v 饥饿法：抗生素淘汰野生型 饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮于无氮基本培养基中培养1-2小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”；加抗生素处理：加入等体积的2N基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。v 制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。v 注意：培养基应添加渗透压稳

18、定剂而制成高渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型提供营养物质。饥饿法v 原理：微生物的某些缺陷型菌株在某些培养条件下会因代谢不平衡自行死亡，可是如果在细胞中发生了另一营养缺陷型突变，这一细胞反而会因代谢平衡的恢复而避免死亡，从而可被浓缩。v 举例：1）胸腺嘧啶缺陷型细菌在不加胸腺嘧啶时在短时间内细胞大量死亡。而残留下来的细菌中可以发现许多营养缺陷型。2）二氨基庚二酸缺陷型：二氨基庚二酸是合成赖氨酸和细胞壁物质的前体。这一缺陷型在不加赖氨酸的情况下不生长也不死亡。给以赖氨酸时反而大量死亡。如果细胞中发生了另一个氨基酸缺陷型突变，它反而可以存活。检出缺陷型 限量补充法MM+0.01%蛋白胨：野生

19、型菌落大，缺陷型菌落小 夹层培养法 制备琼脂平板：培养：长出菌落后作记号 加第四层培养基：CM 培养：新长出的菌落多为缺陷型。夹层平板的制备MMMM+菌液MM 逐个检出法 分离得单菌落：CM 点种：逐个菌落依次点种至MM和CM上 培养：在MM上不长、CM上长的菌落为缺陷型 影印培养法 分离单菌落：CM 影印：用“印章”影印至 MM 和CM上 培养：在MM上不长所对应的CM上的菌落即为缺陷型v 筛选特定的缺陷型时，用SM取代CM则可以得到目的菌鉴定缺陷型-生长谱法 大类的鉴定：v 营养因子：A、酪素水解液（AA混合物）B、水溶性维生素混合液C、酵母核酸水解液（碱基）D、酵母膏水溶液v 方法：缺陷

20、型菌经CM液体培养后，离心洗涤，制成107108个/ml菌悬液。取0.1ml涂布至MM平板上，分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子后，放入接种的MM上，适宜温度下培养v 判断：A、D生长，AA缺陷型B、D生长，维生素缺陷型C、D生长，碱基缺陷型AB、D生长，AA、维生素双缺AC、D生长，AA、碱基双缺BC、D生长，维生素、碱基双缺 详细鉴定v 生长因子组合：10种生长因子分成4组，15种分成5组，21种分成6组。将各营养因子等量混合，研细成粉未；或按照规定量制成混合液。若氨基酸为DL型，则用量加倍。v 方法：直接加固体粉未或用无菌滤纸片取少许混合液加至培养基平板上培养v 判断：生长圈：单缺棱形

21、生长带：双缺或多缺抑菌圈：生长因子浓度过高，且为单缺组 生长因子甲1 2 3 4 5 6乙2 7 8 9 10 11丙3 8 12 13 14 15丁4 9 13 16 17 18戊5 10 14 17 19 20己6 11 15 18 20 21生长因子分组方法营养缺陷型的生长谱鉴定第三节抗反馈调节突变型的筛选及应用一、反馈调节和抗反馈调节突变（一）反馈调节是指当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量积累时，抑制合成代谢途径的关键酶（往往是代谢途径或分支代谢途径第一步的酶）的活力或相关酶的合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。反馈抑制是指合成代谢途径终产物过量积累时对该途径前端某些关

22、键酶酶活性的抑制作用。反馈阻遏是指微生物合成代谢中高浓度终产物对该途径上酶合成的抑制作用。反馈抑制直接以产物浓度控制关键酶的活性，从而控制整个代谢途径，具有快速、有效、经济和直接的特点。反馈阻遏作用是胞内产物过量后终止酶合成的一种机制，与反馈抑制相比，反应较慢，并且往往影响代谢途径中所有酶（整个操纵子）的合成。突变前突变后反馈抑制与抗反馈抑制突变抗反馈阻遏突变的机制（二）抗反馈调节突变是指解除了反馈调节的突变株，包括抗反馈抑制突变和抗反馈阻遏突变。抗反馈抑制突变是指解除了反馈抑制的突变株。（调节中心发生结构改变，无法与效应物结合）抗反馈阻遏突变是指解除了反馈阻遏的突变株。（调节基因突变或操纵基

23、因突变）（三）抗反馈调节突变株的筛选 筛选抗结构类似物突变株 利用回复突变筛选 初级代谢产物营养缺陷型回复突变筛选抗反馈调节突变株（野生型营养缺陷型原养型）次级代谢产物营养缺陷型回复突变筛选抗反馈调节突变株（野生型营养缺陷型原养型）次级代谢产物零产量回复突变筛选抗反馈调节突变株（高产株零变株高产株）二、抗代谢类似物突变型的筛选（一）代谢类似物与抗代谢类似物突变 代谢类似物：结构与（初级）代谢物类似，因此可起到代谢物所具有的调节作用而不具备其生理功能的一类化合物。Threonine AHV a-Amino-b-hydroxyvaleric acid a-氨基-b-羟戊酸 Lys AEC S-(2

24、-Aminoethyl)-L-Cysteine 真正代谢物功能：合成大分子（终产物一般为初级代谢产物，为生长必需）；调节功能（反馈）代谢类似物：只有调节功能，不能合成有活性的生物大分子。加入代谢类似物，将关闭相关代谢物的合成，从而影响微生物的生长。抗代谢类似物突变株：在含有代谢类似物的基本培养基中能够生长的菌株被称作抗代谢类似物突变株。通过基因突变，使变构酶或阻遏蛋白的结构发生改变，使其不能与代谢终产物结合，从而解除了代谢终产物的反馈调节作用，所以即使在代谢类似物存在时，也能合成相关代谢物，从而能够生长。（二）抗结构类似物突变株在代谢调控育种中的应用 抗结构类似物突变的实质是解除了反馈抑制或反

25、馈阻遏，因此，在这类突变株中，合成代谢途径也不再受代谢终产物的反馈调节，能够在终产物过量积累的情况下还不断合成该产物，从而可以大大提高这些终产物的合成量。抗结构类似物突变在氨基酸、核苷酸和维生素等初级代谢产物的高产菌株选育中被广泛应用。（三）筛选方法 一次性筛选法：将经过诱变后培养的细胞直接涂布在含有一定浓度结构类似物的基本培养基平板上，长出的菌落即为抗结构类似物突变株（药物不很贵）；梯度平板法：将经过后培养的细胞涂布在基本培养基平板上，在平板的中央加少量结构类似物，在抑菌圈内长出的个别菌落即为抗结构类似物突变株。注：如果是协同反馈抑制，则要在基本培养基中添加起协同反馈抑制作用的产物 抗结构类

26、似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提高 抗结构类似物突变和营养缺陷型突变等共同使用，提高产量的效果会更好。结构类似物和代谢终产物终产物 结构类似物过量积累产物精氨酸D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸,噻吩丙氨酸苯丙氨酸赖氨酸AEC赖氨酸酪氨酸对氟苯丙氨酸,D-酪氨酸酪氨酸色氨酸5-碱基色氨酸,6-甲基色氨酸色氨酸脯氨酸3,4-二氢脯氨酸,磺胺胍脯氨酸腺苷酸2-氟腺嘌呤腺苷酸葡萄糖2-脱氧葡萄糖 b-葡萄糖苷酶蔗糖,麦芽糖 2-脱氧棉子糖蔗糖酶纤维二糖,葡萄糖甘油 纤维素酶第四节 其它类型突变型的筛选及应用一、组成型突变株的筛选 组成型突变株：在没有诱导底物

27、存在时也能产生大量诱导酶的突变株。筛选原理：通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。筛选方法：创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型突变株的选择优势；选择适当的鉴别培养基，直接在平板上识别两类菌落，从而把组成型突变株选择出来。p 限量诱导物恒化培养法控制低于诱导浓度的诱导物作碳源进行恒化连续培养。诱导型菌株生长极弱，而变异株由于能产分解底物的酶，则能分解底物而得以生长。通过连续不断加入新鲜基质，野生型就会被“洗出”，组成型突变株就被不断“浓缩”，最后达到能分离的浓度。p

28、循环培养法不含诱导物培养基含诱导物培养基(普通碳源或氮源）（诱导物作唯一碳源或氮源）两菌都能生长，但组成型突变株已能合成特定的酶，亲株不能变异株调整期短，亲株调整期长，短时间培养后，变异株所占比例增大 反复循环培养几次后，变异株所占比例逐渐提高，然后进行分离 诱导抑制剂法诱导物作唯一碳源或氮源，添加诱导抑制剂，只有变异株能合成酶利用底物进行生长例：b-半乳糖苷酶诱导物：乳糖诱导抑制剂：邻硝基苯基-b-D-岩藻糖苷 平板菌落识别法例：筛选E.coli b-半乳糖苷酶组成型突变株 将诱变后的细胞涂布接种到以甘油为唯一碳源的平板上 培养后在长出的菌落上喷邻硝基苯半乳糖苷(o-nitropheny-b

29、-D-galactoside,onp-G)三、细胞膜透性突变型1、提高细胞膜透性的优点 使胞内产物浓度维持较低的水平，有利于酶促反应的进行，提高产物的生成量 使胞内产物浓度维持低于发生反馈抑制或阻遏的程度，以积累过量的产物2、提高细胞膜透性的措施例1：谷氨酸生产 生物素对于细胞膜（脂肪酸）的合成是必需的 筛选Bio-，在限量添加生物素的情况下可使合成的谷氨酸大量分泌到胞外，使谷氨酸得以过量积累例2：5-肌苷酸生产 Ade-可以合成5-肌苷酸，但不能分泌到胞外 在限量Mn2+(10 mg/L）时，可以分泌 选育Mn2+浓度（100 mg/L)不敏感突变株，能在过量Mn2+的培养基中正常分泌5-肌

30、苷酸，达到过量积累的目的四、抗性突变株的筛选1、抗性突变株的用途 育种的遗传标记 提高代谢产物的产量2、筛选方法1)一次性筛选法：在对于出发菌株完全致死的环境中一次性筛选少数抗性变异株的方法称为一次性筛选法。如Str抗性突变株的筛选：培养基中添加Str(500U/ml)，长出的菌即为抗500U/ml的菌株。2)阶梯性筛选法 梯度平板法：不含药含药 培养过夜即形成药物梯度平板。涂菌后，在高浓度药物区长出的是抗高浓度药物的菌株 纸片扩散法：在无菌滤纸片上加入一定量的药物，干燥后放入涂布菌体的平板上，在抑菌圈内长出的菌为抗性菌，越接近药物抗性越强。第四节 致癌物质的检测一、诱变作用测定方法概论 灵敏

31、度 链霉素依赖型非依赖型 药物敏感抗性 营养缺陷型非缺陷型 代表性 诱变作用的生物专一性 诱变作用的基因专一性 测定方法：快速、简单固体培养基上诱变作用的测定A-MM，不加诱变剂；B-MM，加诱变剂；C-CM，加诱变剂A B C二、致癌物质的检测（Ames测验）指示菌株：一组具有不同结构改变的组氨酸缺陷型菌株T A1535(rfa,uvrB,hisG46)碱基置换突变T A1536(rfa,uvrB,hisC207)移码突变，GC对缺失T A1537(rfa,uvrB,hisC3076)移码突变，GC对增加T A1538(rfa,uvrB,hisD3052)移码突变,GC和CG对的缺失 前诱变

32、剂：本身不是诱变剂，但在人体或动物体内能转变为诱变剂的物质。鼠肝脏提取物前诱变剂诱变剂 对照 阳性对照：已知诱变剂 阴性对照：无诱变作用的制剂 空白对照：测自发突变率 只有回复突变率比自发突变率高出2倍以上时才能认为该物质有致癌作用。测定结果表明 90%致癌物质是诱变剂 86%非致癌物质不是诱变剂致癌物质 实 验每109个细胞中his+回复子数TA1535 TA1536 TA1537 TA1538(1)2-氨基蒽1、肝脏提取物2、致癌物质3、1+2162131830111217180462711200(2)-萘胺1、肝脏提取物2、致癌物质3、1+2162033020218834211585(3

33、)苯芘1、肝脏提取物2、致癌物质3、1+248774611428161484434515(4)7,12-二甲基苯并蒽1、肝脏提取物2、致癌物质3、1+22935251011115225362088几种致癌物质的诱变作用的测定结果三、菌种的退化、复壮和保藏（一）菌种退化degeneration及其防治1、菌种退化的表现：生产性状劣化，遗传标记丢失，原有的典型性状变得不典型具体表现：菌落及细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；代谢产物生产能力下降；抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱 2、退化原因 基因自发突变；诱变后菌株本身不纯，多核细胞中单核突变，单核细胞中单链改变等；其他原因。

34、总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势。纯是相对的，不纯是绝对的，自发突变率10-810-93、退化的防治 从菌种选育方法上考虑1)进行充分的后培养及分离纯化 2)增加突变位点，减少基因回复突变的几率：从菌种保藏方式上考虑1)尽量减少传代次数2)选择适宜的保藏培养基 从菌种培养适宜条件上考虑 1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞。2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失 从菌种管理的措施上考虑:复壮 1）定期对保藏菌种分离纯化，淘汰已退化细胞；2）定期对发酵液进行分离筛选

35、，选取自发性突变的细胞生产育种（二）菌种复壮rejuvenation广义复壮：在菌种的生产性能尚未退化之前经常进行纯种分离和生产性能测定，从生产中筛选自发正突变的细胞。狭义复壮：在菌种已经发生退化的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从退化的群体中找出少数尚未退化的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。1、纯种分离纯种分离法菌落纯(“菌种”纯)平板表面涂布法平板划线分离法倾注平板分离法细胞纯(“菌株”纯)“分离小室”单细胞分离法显微操纵仪单细胞分离法菌丝尖端切割分离法2、通过宿主体内生长进行复壮3、淘汰已退化的个体 如Streptomyces microflavus“5406”抗生菌的

36、分生孢子，在-10-30 处理57天，死亡率达80%，存活的个体中留下了未退化的健壮个体（三）菌种的保藏 目的：不死，不衰，不被污染，便于研究交换使用 原理：挑选优良纯种，最好是休眠体;创造最有利于休眠的环境条件，创造使微生物代谢不活泼，生长受抑制（休眠）的环境条件，如：干燥，低温，缺氧，缺乏营养，添加保护剂及酸度中和剂等3、方法 1）定期移植保藏法：措施：低温（4）；优点：简便；缺点：保存期短，传代多，易退化 斜面冰箱保藏法 接种适宜斜面培养基 培养 4保藏 适用：各大类 保藏期：36个月 半固体穿刺冰箱保藏法 穿刺接种适宜半固体（0.5-0.7%琼脂）培养4保藏 适用：细菌，酵母 保藏期：

37、612个月2）液体石蜡法（石蜡油封藏法）措施：低温，缺氧方法：斜面或半固体接种 培养 加无菌液蜡高出培养基1cm415 保藏适用：不能利用石油的各大类保藏期：12年优点：简便3）砂土管保藏法 措施：无营养，缺氧，干燥 方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中 干燥 封口 保藏 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：110年或更长4）冻结真空干燥保藏法：措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加 入 安 醅 管 中 低 温 冻 结（-25-40）抽真空（至0.01mmHg）真空封口 检查真空度 保藏 适用：各大类 保藏期：515年或更长5）液氮超低温保藏法：措施：低温、有保护

38、剂-196，10%甘油作保护剂，保藏期长。复习题1、高产突变株筛选的一般步骤。2、诱变育种中菌悬液应如何制备？3、诱变后为什么要进行后培养？如何进行？4、举例说明各种高产菌株的快速平板筛选方法。5、菌种退化的表现、原因、防治方法如何？6、何为菌种复壮？如何进行？7、何为基本、完全、补充培养基？8、何为野生型、营养缺陷型、原养型？9、淘汰野生型的目的、原理及方法如何？10、如何检出和鉴定营养缺陷型突变株？11、何为抗反馈突变株？筛选的原理及方法如何？12、组成型突变株筛选的原理及方法如何？13、细胞膜透性突变株在生产上的优点如何？举例说明筛选的措施。14、抗性突变株的筛选方法如何？15、诱变作用的测定有哪些要求？如何实现？16、Ames测验的指示菌株有什么特点？17、Ames测验的目的如何？如何进行？